阴道上皮细胞转染抗菌肽LL37和防御素5后对假丝酵母菌的抑制作用的讨论.docVIP

阴道上皮细胞转染抗菌肽LL-37和防御素5后对假丝酵母菌的抑制作用的讨论 一、抗菌肽在ⅤⅤC阴道局部免疫中的作用 女性下生殖道为开放性腔道,正常情况下是以乳杆菌等优势菌为主要组成的微生态系统,当受到内源性和外源性因素影响时,很容易发生改变,导致疾病的发生。ⅤⅤC主要由白假丝酵母菌引起,此菌为条件致病菌,其致病性与宿主的免疫状态关系密切,对假丝酵母菌感染的防御机制目前尚不十分清楚。多数研究认为,是阴道局部而不是全身性细胞免疫在宿主的抗感染机制中发挥重要的作用,所以阴道黏膜固有的免疫机制已受到学者的关注。 研究发现,人体基因组中存在近千种编码具有抗生素样活性蛋白的基因,这些基因编码的短肽富含带阳离子的氨基酸残基,称之为“肽抗生素”或“抗菌肽”。抗菌肽可以直接消灭病原体并且可调节宿主免疫和其他生物学反应。女性阴道中抗菌肽的存在及其对抗假丝酵母菌的作用已被许多研究所证实。在体外实验中发现,阴道黏膜上皮细胞对假丝酵母菌有一定的自然抵抗性,在假丝酵母菌刺激下其会分泌具有杀伤作用的抗菌肽,同时促进局部特异性细胞免疫的建立。抗菌肽分泌量的增加对杀灭假丝酵母菌起到重要作用,也是防止ⅤⅤC反复发作的有利保障。防御素家族中HD5除了在肠道黏膜表达以外主要在女性生殖道的复层上皮细胞表达,包括阴道、宫颈、子宫内膜和输卵管,在胎盘和胎膜中也证实有H的存在。人源阳离子抗菌肽18(hCAP-18)是存在于人体的一种抗菌肽,hCAP-18是前体形式,而LL-37则是有活性的成熟形式。这两种抗菌肽对假丝酵母菌都有较强的杀灭作用,并且在阴道上皮细胞中表达量高,故本研究以这两种抗菌肽为研究对象,在前期实验中也证实,ⅤⅤC患者阴道冲洗液中HD5及IL37的含量均有升高,但在复发性ⅤⅤC患者阴道冲洗液中的含量却呈下降趋势,证明抗菌肽的表达下降可能与ⅤⅤC的反复发作有关。 二、阴道上皮细胞转染HD5、LL-37真核重组质粒后HD5、LL-37的分泌情况。 本研究原代培养的阴道上皮细胞稳定传代至第4代后,将人I合成的带荧光蛋白的真核重组质粒pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP禾口pcDNA3.1(+)/LL-37￡GFP转染细胞,结果证实,体外培养的阴道上皮细胞经转染质粒pcDNA3.1( +)/LL-37-EGFP或(禾口)pcDNA3.1(+)/HD5-EGFP后,分泌LL名7及HD5的水平较未转染者明显增加。这种增加趋势在带菌组中更加明显,其中联合转染细胞分泌的LL37、HD5水平最高,说明阴道上皮细胞自身有一定水平的抗菌肽分泌,但这种分泌是一种持续的低水平稳定状态,假丝酵母菌的存在能促进阴道上皮细胞抗菌肽的分泌,而转染质粒后LL-37、H“分泌水平明显增加,其中带菌组的联合转染亚组分泌水平在各时段均为最高值,峰值出现在转染后zh,说明转染zh时HD5和LL-37分泌水平最高。这与Kehlle等的研究结果一致,即防御素表达的增加可以有效地抵御假丝酵母菌的侵袭,同时将感染限制在上皮的表层。本研究证实,阴道上皮细胞对假丝酵母菌有天然的抵抗作用,但自然状态下抗菌肽的分泌量有限,感染后抗菌肽的分泌量会增加,但增加的量不足以抵抗假丝酵母菌对上皮细胞的侵袭,阴道微生态平衡被破坏,对一些抗假丝酵母菌药物产生耐药,则出现反复感染及难治性ⅤⅤC。 二、阴道上皮细胞转染HD5。LL-37重组质粒后对假丝酵母菌的抑制作用。 抗菌肽抗假丝酵母菌的机制主要是在真菌细胞膜上形成离子通道,破坏胞膜的完整性造成细胞死亡。本研究利用葡萄糖消耗法检测阴道~L皮细胞对假丝酵母菌的抑制效果,在葡萄糖低浓度时,假丝酵母菌必须消耗能量以主动运输方式来转运葡萄糖进人细菌胞体内,由于HD5及LL37对其的抑制和消灭,假丝酵母菌细胞能量代谢水平低下,无法摄取足够的葡萄糖。葡萄糖消耗百分率与假丝酵母菌细胞受抑制程度呈反比,通过比较不同细胞不同时段培养上清液中的A值反映葡萄糖的剩余量,以数值形式客观地反映假丝酵母菌的代谢水平,进而比较阴道上皮细胞的抑菌效果。本研究不同时段带菌组中联合转染亚组抑菌效果(A值)明显高于其他各亚组,随时间延Κ带菌组中各亚组A值均呈下降趋势,假丝酵母菌消耗的葡萄糖量逐渐增多,但联合转染亚组A值下降趋势较转染一种质粒或未转染质粒的亚组缓慢,说明联合转染质粒后由于LL-37及HD5分泌量最多,阴道上皮细胞对假丝酵母菌的抑制率也最高。证实转染两种质粒有协同促进作用,使LL-37及H的分泌水平均增加,并且使阴道L1皮细胞抵抗假丝酵母菌的能力显著增强。这与“lDcz GarcⅠa等:IO将LL-37加人白假丝酵母菌的体外培养纂中、LL-37表现出抑菌作用的结果一致: 此外,倒置显微镜下观察假丝酵母菌生长的状况,发现联合转染亚组假丝酵母菌生长密度无明显增加,转染质粒48h