郭江波分子生物学讲义第八章.ppt

DNA甲基化转录抑制机制 是DNA甲基化直接干扰特异转录因子与各自启动子的识别位置结合; 几种转录因子，如AP一2，C—MYc／Myn，CARBE，E2F和NF—kB，能识别含CpG残基的序列。当CpG残基上的C被甲基化后，结合作用即被抑制。相反，其他一些转录因子(如SPI和CTF)对结合位置上的甲基化不敏感，还有许多闪子在DNA上的结合位点上不含CpG二核苷酸，DNA甲基化对这些转录因子基本不起抑制作用。 通过在甲基化DNA上结合特异的转录阻遏物，或称为甲基CpG结合蛋白而起作用。这种蛋白质能与转录闲子竞争甲基化DNA结合位点。迄今为止，已经鉴定了两种这样的转录阻遏物，即MeCPI和MeCP2(甲基胞嘧啶结合蛋白1和2)。 甲基化抑制机制是影响染色质结构 DNA甲基化研究方法 基因组DNA基化检测：有限制性内切酶酶解法（甲基化敏感扩增多态性技术性(methylation sensitive amplification polymorphism，MSAP)）、甲基化酶温育法、高效液相色谱(HPLC) 特定DNA片段的甲基化检测 亚硫酸氢盐预处理法(甲基化特异的PCR(MSP), 变性高效液相色谱法(DHPLC) , 联合亚硫酸氢钠限制性内切酶分析法 (combined bisulfite restriction analysis，COBRA ),甲基化敏感性单链核甘酸引物延伸(MS-SnuPE))、联合甲基化敏感的限制性内切酶法、微阵列技术(DNA Microarray） eIF-2磷酸化对翻译起始的影响 eIF-2磷酸化对翻译起始的影响：用兔网织红细胞无细胞体系体外翻译时发现，如果不向这一体系添加血红素，几分钟后蛋白合成会下降且停止。 CBPⅡ活性与翻译的起始 真核生物mRNA的5′端都有帽子结构，帽子结构与mRNA的蛋白质合成效率之间关系密切。蛋白质合成起始时如何识别5′端帽子结构呢？研究表明，细胞内存在着能与mRNA 5′端帽子结构相互作用、专一性识别帽子结构的蛋白质，称之为帽子结合蛋白(cap binding protein，CBP)。其中，CBPⅠ能促进有帽子结构的mRNA翻译，但对没有帽子结构的mRNA无效；CBPⅡ是能在高盐浓度下稳定存在的复合物，它由三种多肽成分组成，其中第一种是CBPⅠ，第二种是相对分子质量为2.2×105的未知功能多肽，它可能就是eIF-4A。CBPⅡ又称为eIF-4F，它也有促进有帽子mRNA翻译的功能，在体外能使球蛋白mRNA的翻译达到最高峰。 ?在脊髓灰质炎病毒感染的HeLa细胞中，有帽子结构的宿主mRNA的翻译受阻，宿主蛋白质合成迅速停止，但没有帽子结构的脊髓灰质炎病毒mRNA的翻译却不受影响。研究表明，宿主细胞CBPⅡ的失活是导致这种mRNA选择性翻译的主要原因。如果在这种感染细胞抽提液的蛋白质合成体系中加入由兔网织红细胞提取的CBPⅡ，则可恢复的帽子mRNA的翻译活性。但是添加CBPⅡ对脊髓灰质炎病毒mRNA的翻译没有影响。目前还不了解脊髓灰质炎病毒感染后CBPⅡ失活的机制，一般认为CBPⅡ中功能不明的2.2×105的多肽分解为1.0×105~1.3×105片段是一个主要原因。与脊髓灰质炎病毒同属细小核糖核酸病毒群的鼻病毒14也有使CBPⅡ失活的功能，但是却没有引起CBPⅡ中2.2×105蛋白质组分的分解，所以认为这一病毒关闭宿主蛋白质合成的机制是与脊髓灰质炎病毒不同的。 2.3. mRNA的稳定性与基因表达调控 在高等真核生物中转运铁蛋白受体（TfR）和铁蛋白负责铁吸收和铁解毒。这两个mRNA上存在相似的顺式作用元件，称为铁应答元件（IRE），IRE与IRE结合蛋白（IREBP）相互作用控制了这两个mRNA的翻译效率。 当细胞处于缺铁或高铁水平时，能产生两个数量级的蛋白水平差异，却没有在mRNA水平上发现存在显著差异。 研究表明，位于5’非翻译区的IRE控制了铁蛋白mRNA的翻译效率，去掉这个非翻译区IRE，可造成铁蛋白的永久性高水平翻译。当细胞缺铁时，IREBP与IRE具有高亲和力，两者的结合有效地阻止了铁蛋白mRNA的翻译。与此同时，TfR mRNA上3’非翻译区中的IRE也与IREBP特异结合，有效地阻止TfR mRNA的降解，促进TfR蛋白的合成。 * * 人铁蛋白及铁转运蛋白受体mRNA的翻译调控区域 2.4.可溶性蛋白因子的修饰与翻译起始调控 许多可溶性蛋白因子（起始因子），对蛋白质合成的起始有着重要的作用，对这些因子的修饰会影响翻译起始。 在蛋白质生物合成的过程中，特别是在起始反应中，mRNA的“可翻译性”是起决定作用的，其5末端的帽子结构、二级结构、与rRNA的互补性以及起始密码附近的核苷酸序列都是蛋白质生物合成的信