家蚕铁蛋白基因克隆、表达及其生物学的分析.docxVIP

家蚕铁蛋白基因克隆、表达及其生物学的分析.docx

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学位论文版权使用授权书 江苏大学、中国科学技术信息研究所、国家图书馆、中国学术期刊(光盘版) 电子杂志社有权保留本人所送交学位论文的复印件和电子文档,可以采用影印、 缩印或其他复制手段保存论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致, 允许论文被查阅和借阅,同时授权中国科学技术信息研究所将本论文编入《中国 学位论文全文数据库》并向社会提供查询,授权中国学术期刊(光盘版)电子杂 志社将本论文编入《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》并向社会提供查询。 论文的公布(包括刊登)授权江苏大学研究生院办理。 本学位论文属于不保密囵( 学位论文作者签名:  Z孝吞  指导教师签 20  I弓年占  月  ,2日  加八f年 江苏大学硕士学位论文 摘  要 铁元素是生命体中必不可少的微量元素,在生物的生长发育过程中发挥着重 要作用。铁蛋白,一种分布广泛的球形蛋白,能够以稳定的形式大量储存铁。铁 蛋白通过储存和释放铁来维持机体内铁平衡。铁蛋白不仅是机体中重要的铁储存 蛋白,也能有效保护生物体免受来自氧自由基的损伤。与此同时,铁蛋白含量可 以作为一些疾病预防检测的明确指标。对铁的代谢吸收及铁对基因调控的研究, 进一步说明了维持铁平衡对生物体有重要意义。同时,相对于只能携带两个铁原 子的转铁蛋白,铁蛋白结合铁的能力更强具有更高的效率。昆虫的铁蛋白属于分 泌型铁蛋白,更有可能具有运输铁的能力。人体铁蛋白受体的发现表明铁蛋白运 送铁这一功能是保守的,所以昆虫铁蛋白功能研究有助于发现人体铁蛋白功能研 究方向。目前,人们已经鉴定了多种生物的铁蛋白基因,但是还没有对家蚕铁蛋 白基因的相关报道。作为一种重要的模式生物,家蚕世代形态分明,方便进行各 组织取材,与果蝇相比个体大小适中,便于观察与采集。 本文通过在GenBank数据库中查询得到家蚕的铁蛋白基因,利用生物信息学 方法进行初步的分析和比较,查找到家蚕铁蛋白两个亚基FerHCH与FerLCH的基 因序列。依据查询的序列设计引物进行PCR扩增,构建重组载体转化到大肠杆菌 BL21(DE3)中进行表达。分别得到了分子量约为21kDa与24kDa的重组蛋白。 经过质谱鉴定,与查找到的肽段相一致。纯化重组蛋白并制备识别家蚕铁蛋白H、 L和HL的多克隆抗体。应用蛋白免疫印迹(Westem Blot)技术初步检测铁蛋白在 家蚕不同组织不同龄期中的表达。结果发现对于五龄的家蚕,脂肪体、精巢、卵 巢中铁蛋白的表达量要明显高于其他组织;而对于不同龄期的家蚕,卵、蛹、蛾 的铁蛋白量明显高于其他龄期。在大肠杆菌中表达的重组家蚕铁蛋白是以不可溶 的包涵体形式存在。用变性剂8M尿素溶解包涵体蛋白,除去高浓度尿素引导蛋白 重新折叠,获得可溶性家蚕铁蛋白。应用聚丙烯酰胺凝胶电泳与铁染色检测重折 叠的家蚕铁蛋白表明其具有特定四级结构并且能储存铁。对该重组蚕铁蛋氧化亚 铁能力的定量测定进一步表明重组蛋白具有活性。而且家蚕铁蛋白氧化亚铁活性 耐受高温和极性pH的处理,这与其它物种的铁蛋白高度稳定这一特性一致。 关键字:铁蛋白,家蚕,原核表达,蛋白重折叠 家蚕铁蛋白基因的克隆、表达及其生物学分析 江苏大学硕士学位论文 Abstract Iron is  an  essential micronutrient for growth and development of living organisms. Ferritin is  a  widely distributed globular protein,designed to accommodate large amounts of iron in  a safe,soluble and bioavailable form.It acts  as a buffer against iron deficiency and iron overload by iron stores and releases.It is vital for life because it is the primary iron storage protein,and protecting the organism from damage of reactive oxygen species.At the same time,ferritin level in serum can be used as the biomarker of the presence of  a disorder  or disease.The study of iron metabolism and regulation reveals st

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