海莲耐盐基因AOC克隆及转录融合表达载体的构建.pdf

维普资讯 第 27卷 第 3期 热 带 作 物 学 报 Vo1．27 No．3 2006年 9月 CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS Sep．2006 海莲耐盐基因AOC克隆及转录 融合表达载体的构建 段瑞军 郭建春 胡新文 刘国道 符少萍 轰热带作物生翥物蓑技术国家重点瓣实验室海口57¨u0-1 摘 要 利用 RT—PCR的方法从红树林海莲中克隆丙二烯环化氧化酶基 因 (AOC)，并进行序列测定和 BLAST程序进行同源序列分析。从RT—PCR得到的产物 ，其核苷酸序列与GeneBank中海莲丙二烯环化氧化 酶基因AOC(BAB21610)的核苷酸序列完全相同。AOC基因通过中间载体 pBS—AOC，pJIT60一AOC，最后克隆 到植物表达载体pGreenI10229上，得到双 35S的pGreenI10229一AOC植物表达载体。AOC基因和 ipt基因通过 中间载体pBS-AOC，pBS—ipt，pBS—AOC—ipt，pJIT60一AOC—ipt；晟后将AOC和 ipt基因以转录融合的方式克隆 到植物表达载体 pGrcenI[0229E，得到具有双 35S启动予 的AOC，ipt双基 因转录融合 的植物表达载体 pGreenI10229一AOC-ipt。 关键词 AOC基因 ipt基因 2S0229一AOC植物表达载体 2S0229一AOC—ipt转录融合植物表达载体 中图分类号 Q78 AOC基因在植物中普遍存在，研究发现红树林植物海莲中的AOC基因能增强耐盐性…。找到耐盐 特异基因会对植物产量有很大的影响，因为盐压是限制植物生长和产量的主要因子 2【]。通过功能筛选的 方法从红树林海莲中克隆到 1个 l0l9bp的cDNA全序列，该序列编码 256个氨基酸。该氨基酸序列与 马铃薯、拟南芥AOC基因编码氨基酸序列同源性很高，这些氨基酸序列保守性很强，但这些序列的N 端在植物种问完全不同。把该cDNA序列、马铃薯AOC基因以及拟南芥AOC基因导入大肠杆菌，所有 的转化子都能在 86mmol／L的NaC1培养基上生长，而只有导入该cDNA全长序列的转化子才能在400 mmol／L的NaC1培养基上生长。进一步分析其功能区，发现从第 16～86问的70个氨基酸对增强耐盐是 必需的；其中蛋 白质的2个区域 (16～35区和 64～86区)表现出保护蛋 白质结构的活性 ”【。根据Kozak{ 核糖体转录翻译原则：受控于同一启动子的转录融合基因，启动子将就近优先启动。既相对独立的双基 因如果受控于同一启动子，距离启动子近的基因的表达量将大大的高于距离启动子远的基因的表达 量。郭建春 将GUS基因和细胞分裂素合成关键酶基因(ipt)以转录融合的方式进行双基因表达，构建 了2组35S—ipt：：：GUS和 35S—GUS：：：ipt转录融合植物表达载体并导入遗传模式作物拟南芥，结果表明， 在 35S—ipt：：：GUS表达系统中ipt的表达量大于35S—GUS：：：ipt表达系统中的ipt的表达量：而在 35S— GUS：：：ipt表达系统中，GUS基因的表达量大于 35S—ipt：：：GUS表达系统中GUS基因的表达量，转基因 植物具有生长快，侧枝多、开花早、种子多等特点。在此研究的启发下，笔者构建了ipt和AOC转录融合 表达载体 35S一35S一0229AOC：：：ipt以及其对照载体 35S一35S一0229AOC，用于植物的遗传转化，以期提高 作物的耐盐能力和生长速度。这为获得既耐盐又能快速生长的转基因植物新品种奠定基础。 1 材料与方法 1．1 材 料 ~[Bruguierasexangula(Lout．)Poir]~采 白海南省东寨港红树林 自然保护区：质粒：pBS，pBS—ipt， pJIT60，pGreenl10229，转化受体菌 DH5ct为中国热带农业科学 院，生物技术 国家重点实验室保存 ； 教育部重点项 目(204158)，人事部留学人员科技活动项 目，中国热带农业科学院院基金(脚 0526)资助 段瑞军 男