细胞生物作业-TALEN基因编辑.docVIP

TALEN技术的基本原理和方法 摘要：TALEN技术是一种通过依赖TALEs酶和核酸内切酶组成的复合体，来特异性的识别靶基因序列，并对其进行切割，从而引发修复机制从而完成基因的敲除和修饰。TALEN技术的操作分为四步;1.确定靶点2.人工构建重复序列3.真核表达载体的构建和反应4.筛选头突变体；TALEN技术现在已经有了很广泛的应用，并将不断地发展和进步。 关键字：TALEs TALEN 基本原理 操作技术 应用 The fundamental principle and method of TALEN technology LiuTong Abstrict:TALEN technology is a kind of relying on TALEs of endonuclease and enzyme complex, to specific identification of a target gene sequences, and carries on the cut, causing repair mechanisms to complete gene knockout and modification.TALEN technology operation is divided into four steps;1. Determine the target 2. Artificial building repeat sequence (3) the construction of eukaryotic expression vector and response 4. Screening mutant;TALEN technology now has a wide range of application, and will continue to development and progress. Key word: TALEs TALEN fundamental principle operation technology adhibition TALE 核酸酶 ( TALE nucleases，TALENs) 是由 TALEs DNA 结合域和内切核酸酶 Fok切割域融合而成．其中，TALEs 的DNA 结合域能够识别特异的 DNA序列，FokI可通过二聚体产生核酸内切酶活性，在特异的靶 DNA序列上产生双链断裂．细胞在修复双链断裂的过程中，可产生各种类型的序列改变．根据 TALEs 的结构特点，理论上可以设计出能够识别并结合任意靶序列的TALENs ．而且 TALENs 的操作简单，没有筛选的过程，组装完成后即可进行活性验证，因此，该技术在酵母、动植物细胞的基因组定点修饰、遗传疾病的基因疗法及基因的 功能研究等方面具有广泛的应用前景． TALEN技术的基本原理【图三】 1.1 TALEN的基本结构 TALEN是由TALEs和核酸内切酶FOLK1组成的能够特异性识别和切割特定的DNA分子。【图一】TALEs 具有特殊的结构特征，包括 N 端分泌信号、中央的 DNA 结合域、1 个核定位信号和 C 端的激活域 ．通过对目前发现的所有 TALEs蛋白分析发现，TALEs 蛋白中DNA 结合域有1个共同的特点，不同的 TALEs 蛋白的 DNA 结合域是由数目不同的( 12 ～ 30) 、高度保守的重复单元组成，每个重复单元含有 33 ～ 35 个氨基酸．这些重复单元的氨基酸组成相当保守，除了第 12 和 13 位氨基酸可变外，其它氨基酸都是相同的，这两个可变氨基酸被称为重复序列可变的双氨基酸残基( repeatvariable di-residues，RVD ) ．TALEs 识别DNA 的机制在于每个重复序列的 2 个 RVD 可以特异识别 DNA 的 4 个碱基中的 1 个，目前发现的RVD 共有 5 种． 统计分析发现，HD( 氨基酸名称) 特异识别 C 碱基，NI( 氨基酸名称) 识别 A 碱基，NN( 氨基酸名称) 识别 G 或 A 碱基，NG( 氨基酸名称)识别 T 碱基，NS( 氨基酸名称) 可以识别 A、T、G、C中的任一种。通过对天然 TALE 的研究发现，TALEs 蛋白框架固定识别1个T碱基，所以靶序列总是以T碱基开始。在TALEs的DNA的5’端加一段FOLK1的序列就可以表达出在TALEs的C端加一个FOLK1核酸内切酶的TALEN复合物。 图一 TALEs结构示意图 1.2 TALEN特异性识别DNA序列和的原理 通过对靶基因的测序，我们可以获得需要特异性识别的序列。通过特异的DNA靶序列我们可以反推出我们所需要的TALEs中的进行特异性识别靶序列的TALEs的序列，从而可以人