食品分《蛋白质及氨基酸含量的测定》(第9章).pptVIP

1、薄层色谱法（薄层层析法（TLC 法）Thin Layer Chromatography 简介： 近年来发展起来的一种微量而快速的层析方法，它把吸附剂或支持剂均匀的铺在玻璃板上成一薄层，把样品点在薄层上，然后用合适的溶剂展开，从而达到分离、鉴定和定量的目的。因为层析在薄层上进行，所以称为薄层层析。它的应用范围比纸上层析更广泛，常用来分析氨基酸、农药残留量、黄曲霉毒素等。 2、茚三酮比色法 原理：氨基酸在一定条件下与茚三酮起反应，生成蓝紫色化合物，可定量比色。 氨基酸的分离与测定 取一定量经水解的样品溶液，滴在制好的薄层板上，在溶剂系统中进行双向上行法展开，样品各组分在薄层板上经过多次的被吸附、解吸、交换等作用，同一物质具有相同的Rf值，不同成分则有不同的Rf值，因而各种混合物可达到彼此被分离的目的。然后用茚三酮显色，与标准氨基酸进行对比，鉴别各种氨基酸种类，从显色斑点颜色的深浅可以大致确定其含量。 原 理： Rf = a / b a b 溶剂前沿 样 点 点样原点 ① 展开时间短，一般在20—30分钟，展开距离通常只需10 cm，且分离效果好。 ② 层析后得到的斑点小而清晰。 ③ 能够使用多种显色剂。 ④ 点样量少，灵敏度高。（比纸层析高10—100倍） 精确到0.01ug。 ⑤ 也可用于大量分离＞500 mg，作为样品制备层析。 缺点：Rf值重现性比纸上层析差。 分类：按层析的原理可分为：吸附、分配、离子交换、凝胶等。 优 点： ① 薄层板制备 ② 样品液制备 ③ 点样：距薄板底端2cm处，用针画一标记作为原点。再以点样距扳子宽窄可点几个点同时展开，点与点之间间隔1～2cm。 a.可用毛细玻璃管、微量吸管或微量注射器。注意要等一个点干了再点另一个点。 b.用一小直径ф3 mm 滤纸片，浸入样液，埋到板子上先挖好一个小洞穴。 操作方法： 展开：点样完了，放入密闭容器中（展开槽），倾斜一定角度10～30°，下端浸入展开剂1cm，千万别让溶剂浸过了样点。到离顶端一部分，取出样板、晾干、显色。 展开剂的有关情况：主要是低沸点的2～3种有机溶剂组成的溶剂系统，分离效果主要决定于展开剂的选择，因为吸附剂在一定情况下是恒定的，吸附剂的选择余地远远小于展开剂的选择。 Ⅰ.微量圆环法。 Ⅱ.用小载玻片试验，微量展开剂展开5cm。 Ⅲ.图解法： 样品极性小，选吸附剂活性高，展开剂极性低的。 样品极性大，选吸附剂活性低，展开剂极性高。 有机溶剂极性由小到大为： 石油醚、环己烷、四氯化碳、三氯乙烷、甲苯、苯、二氯甲烷、氯仿、乙醚、乙酸乙酯、丙酮、正丙醇、乙醇、甲醇、水、吡啶、有机酸类等。 展开剂的选择方法： 上行法、下行法、双向展开、单向多次展开、双向多次展开。 展开的方式： 双向展开： a.喷适当的溶液，使斑点显色，即喷雾显色。 b.喷有荧光反应的物质，在紫外光下观察斑点。 c.将涂有荧光指示剂的薄层板放在紫外灯下观察。 （涂板时把荧光指示剂加入到固体吸附剂中） 定性：在同一块板上，同等条件下操作，被测样与标准样同时展开、显色，同 Rf 值即是；查手册找相同的 Rf 值。 定量：a.目视定量法：以标准斑点对照，相当于样品斑点中含量ug数。 b.斑点面积定量法。 c.将样点取下来，定容，离心，比色。 d.利用薄层色谱扫描仪： 例：日本岛津 CS——910 型双波长薄层色谱扫描仪。 显 色： 1.LBG — 1型离心薄层色谱仪 北京产 2.7924型离心薄层色谱仪 美国Harrison 公司研制 3.CLC — 5型离心制备液体色谱仪（日本日立公司，带紫外检测器、记录器和自动收集器，制备量可达 10g 。 4.氨基酸自动分析仪法 5.气相色谱法 6.高效液相色谱法 离心薄层色谱仪： 写出食品中蛋白质测定的几种常用方法？ 食品中氨基酸的测定有哪几种常用的测定方法。 设计凯氏定氮法测定蛋白质含量的基本原理、步骤、结果计算和操作注意事项及该方法的优缺点。 写出双缩脲法测定蛋白质含量的基本原理。 写出氨基酸态氮测定的基本原理。 写出挥发性氨基氮测定的基本原理。 作 业 浙江科技学院 生物与化学工程学院 刘 铁 兵tbliu@126.com 食品分析 * 无氨蒸馏水的制备方法： 于普通蒸馏水中，加少量的高锰酸钾至浅紫色，再加少量氢氧化钠至呈碱性。蒸馏，取其中间蒸馏部分的水，加少量硫酸溶液呈微酸性，再蒸馏一次。 氨基酸 第9章：蛋白质及氨基酸的测定Chapter 9 Analysis of protein and amino acid 浙江科技学院 生物与化学工程学院 刘铁兵tbliu@126.com 浙江科技学院 生物与化