玉米螟高毒力生防菌株筛选与发酵工艺探讨.doc

玉米螟高毒力生防菌株筛选与发酵工艺研究 　　摘要：以玉米螟（Pyrausta nubilalis）为对象筛选出一株高毒力生防菌株苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）NBIC380。通过培养基优化，获得适宜的培养基配方D。补料发酵研究的结果表明，固定氮源浓度为80 g/L，发酵前期补料效果明显，补料速率为根据发酵不同阶段进行调整，可以取得更好的发酵结果，有利于提高产量，降低生产成本 关键词：玉米螟（Pyrausta nubilalis）；生防菌株；发酵 中图分类号：S433.4；Q813.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）24-6248-04 DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.24.039 Abstract： A biocontrol strain Bacillus thuringiensis NBIC380 with high virulence to Pyrausta nubilalis was obtained. According to this strain， appropriate media formulations D was obtained by medium optimization. Fed-batch fermentation experiments showed fermentation pre-feeding effect was obvious by using 80 g/L nitrogen concentration. Feeding rate was adjusted according to the different stages of fermentation. This strategy could improve production and reduce production costs. Key words： Pyrausta nubilalis； biocontrol strain； fermentation 玉米螟（Pyrausta nubilalis）是世界性害虫[1]，在中国各玉米产区均有发生，使用化学防治带来的农药残留危及食品安全，尤其是随着鲜食玉米消费量的不断上升，使得问题更是突出。20世纪60年代，国内就开始尝试采用Bt制剂拌土或细砂后灌心，或者使用飞机喷雾防治玉米螟低龄幼虫[2，3]。市面上多数Bt制剂产品对玉米螟幼虫都有一定的效果，但没有以玉米螟为靶标进行筛选的专用菌种[4，5]。为此，本研究旨在建立以玉米螟初孵幼虫为靶标的高毒力菌株筛选体系，并开展其工程化技术研究开发[6，7] 1 材料与方法 1.1 材料 菌种：Bt菌种1～15号，均由湖北省生物农药工程研究中心自行分离并保存，均可用于Bt产品生产。对照菌株MP-18，由湖北康欣农用药业有限公司提供 供试虫：玉米螟采自黑龙江省，由湖北省生物农药工程研究中心养虫室保种并培养，提供供试初孵幼虫 培养基A、B、C、D均为湖北康欣农用药业有限公司筛选优化的Bt生产用培养基。分批发酵培养基：碳源浓度为25 g/L，氮源浓度为55 g/L，pH 6.5～7.0。补料发酵培养基起始碳源浓度 15 g/L，氮源浓度80 g/L，pH 6.5～7.0 1.2 方法 1.2.1 混菌法 参照国家标准GB/T 19567.1-2004中棉铃虫生物测定方法进行 1.2.2 分批发酵方法 从斜面上接一环菌入摇瓶种子培养基中，28 ℃，200 r/min下培养至对数期后期，以5%接种量接入400 L种子发酵罐中，装料240 L，罐压0.02 MPa，在发酵过程中通过空气流量及搅拌转速对溶氧进行控制， pH不予控制。镜检观察，种子长到合适的阶段后，压入5 t罐继续发酵培养，待晶体形成并脱落1%～5%，放罐 1.2.3 补料发酵方法 前期的补料发酵在500 mL三角瓶中进行。小试在20 L不锈钢自动发酵罐中进行补料发酵。中试在生产车间5 000 L发酵罐中进行补料发酵。小试发酵过程中各种数据电脑监控记录， pH、溶氧由pH电极和溶氧电极在线检测，搅拌转速在100～500 r/min内无级调速，投料体积12 L；培养基121 ℃灭菌30 min，通气量2 m3/h 摇瓶补料发酵：氮源一次添加，补加碳源为液化淀粉，维持总碳源浓度为30 g/L，发酵12 h补加剩余碳源，培养至孢晶20%分离时下摇床 20 L及5 000 L发酵罐补料发酵：根据pH变化确定补料时机，当淀粉液化完成、pH即将回升、有机酸等中间代谢积累物开始快速被利用时，开始补料。此时细胞对氧的需求加大，