生化与分子生物学分子部分.ppt

生化与分子生物学实验 概述 实验设计： Get to know the protein you want to clone Acquire the coding sequence of the protein Decide the vector you want to use Design primers for coding sequence PCR Prepare PCR templates PCR and prepare insertion fragment (digestion ) Prepare vector fragments (digestion, purification) Ligation, transformation, screening, verification Transfer expression plasmid to expression host cells Expression, purification, characterization of cloned protein 生化与分子生物学实验I 实验用试剂的配制. 器皿的准备及灭菌 实验内容（以下内容均按每小组4人计算） 1）每小组共配制 100ml为固体培养基， 装在250ml锥型瓶中； 高压灭菌（121℃/20min）， 然后4℃放置备用。 LB固、液体培养基配方（按1L计算） Tryptone 10g (1%) Yeast Extract 5g (0.5%) NaCl 10g (1%) 加蒸馏水溶解，用NaOH调pH值至7.0，定容到1000ml。 固体培养基加琼脂粉浓度为1.5%（W/V) 2). 20ml 0.1M CaCl2 （ MW：111） 3). 培养皿（4块） 包裹， 4). 大（蓝色）和小（黄色）枪头各2盒　　 5). 1.5ml Eppendorf管一烧杯 灭菌（121℃/20min） 实验 一. pTKD GI质粒 DNA的提取、与酶切 l.1 质粒DNA的提取 原理： 　　　质粒(plasmid)是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1一2OOkb之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体申，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也可对宿主细胞的相应缺陷进行补偿。 本实验分离纯化的质粒为插入一个外源GI基因到 pTKD 质粒中的 pTKD GI质粒, 长度大约为 4.3 + 1.2 (kbp). 所有分离质粒DNA的方法都包括三个基本步骤: 1.培养细菌使质粒扩增; 2.收集和裂解细菌; 3.分离和纯化质粒DNA。 离心机的正确使用： 平衡： 在转子的对称位置的管子 等重量，小的台式离心机则仅要求对称位置2管要等体积 大肠杆菌质粒DNA的分离及纯化（碱变性法） 试剂： 1. Solution I (GET): 5O mmol/L 葡萄糖， lO mmoI/L EDTA-Na2( pH8.0) 25 mmol/L Tris-HCl ( pH8.0) 2. Solution II: 0.2mol/L NaOH 1% SDS 3. Solution III 60ml 5m