蝇蛆抗氧化肽制备与`其纯化.doc

蝇蛆抗氧化肽的制备及其纯化 　　摘 要：以DPPH自由基清除率为评价指标，通过单因素试验和正交试验优化碱性蛋白酶水解蝇蛆蛋白制备抗氧化肽的工艺条件。采用超滤、Sephadex G25凝胶过滤层析对蝇蛆蛋白水解物进行分离纯化，筛选高抗氧化活性组分。结果表明，酶法制备蝇蛆蛋白抗氧化肽的最佳工艺条件为：加酶量7000 U/g，底物质量浓度1%，酶解时间15 min，酶解温度50℃，pH值7.5。水解物经超滤得到相对分子量大于10 kD、5～10 kD以及小于5 kD的组分，以小于5 kD组分清除DPPH自由基活性最强。该组分通过凝胶过滤层析进一步分离得到2个组分，其中组分Ⅱ的清除DPPH活性明显高于组分Ⅰ，达到81.83 ± 0.80%。酶解产物经2步纯化后，其DPPH清除活性得到了显著提高，提高约57.88% 关键词：家蝇幼虫；抗氧化肽；工艺条件；分离纯化 中图分类号： Q969.97 文献标识码：A DOI：10.11974/ nyyjs.20160909001 家蝇（Musca domestica）幼虫，又名五谷虫，俗称蝇蛆，其干燥物为中药罗仙子。据《本草纲目》记载，罗仙子具有“治小儿诸疳积、疳疮，热病谵妄，毒痢作吐”的功效。现代科学实验表明，蝇蛆富含蛋白，并且其组成氨基酸较为齐全，另外还有丰富的维生素、甲壳素、矿物质以及微量元素等，具有较高的营养价值[1]。从蝇蛆中提取的抗菌肽对耐药菌株具有较强的抑制活性[2]，在鸡饲料中添加蝇蛆肽具有调节和改善鸡肠道菌群以及提高营养物质可利用率的作用[3]，在鲫鱼饲料中添加蝇蛆粉可增强鱼体非特异性免疫功能[4]。说明蝇蛆在饲料、食品添加剂方面具有较高的潜在应用价值。此外，研究发现蝇蛆提取物还具有清除氧自由基[5]、抗炎和抗动脉粥样硬化的作用[6]，提示蝇蛆可能是一种良好的食品、保健品资源，为蝇蛆更深度的开发利用提供了新的方向 抗氧化多肽作为天然抗氧化剂，与合成抗氧化剂相比，具有更高的安全性。而蝇蛆繁殖周期短，饲养成本低廉，因此，从蝇蛆中制备抗氧化肽不失为一种好的选择。目前，主要通过酶解法和发酵法来制备抗氧化肽。本试验以DPPH自由基清除率为抗氧化活性评价指标，优化酶解法制备蝇蛆抗氧化肽工艺条件，并对酶解产物进行分离纯化，为蝇蛆抗氧化肽的开发利用提供实验依据 1 材料与仪器 1.1 材料 种蝇，获赠于广东省疾病与控制中心，双翅目（Diptera），蝇科（Muscidae），蝇属（Musca），家蝇（M.domestica）；3日龄家蝇幼虫，由实验室自行繁殖饲养获得；碱性蛋白酶（P4860-50ML），SIGMA公司产品；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（2，2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH），SIGMA公司产品 1.2 仪器 电子天平，Sartorius公司提供；分光光度计U-2900，HITACHI公司提供；HH-3A数显恒温三温水浴锅，金坛市精达仪器制造厂提供；电热鼓风干燥箱，上海恒科学仪器有限公司提供；高速冷冻离心机，Eppendorf公司提供；Lab scale小型切向流超滤系统，Millipore公司提供；快速蛋白纯化系统，由AKTA公司提供 2 试验方法 2.1 家蝇幼虫的处理及蛋白提取 收集3日龄家蝇幼虫，用蒸馏水反复清洗以去除杂物，经沸水烫漂后置于50℃烘干，粉碎，索氏脱脂（溶剂为石油醚），烘干，过40目筛，备用 称取脱脂蛆粉50g，加水500mL，充分混匀，调pH至10.5左右，置于50℃恒温水浴锅，提取3h。浸提后以5000 r/min离心15min，取上清液。再调pH至4.5，于4℃下静置2h。以5000 r/min离心15min，取沉淀，将pH调至7.0，透析以脱盐，冷冻干燥后备用[7] 2.2 家蝇幼虫蛋白酶解单因素试验 以DPPH自由基清除率为评价指标分别考察加酶量、底物质量浓度、酶解时间、温度和pH 5个因素对家蝇幼虫蛋白抗氧化肽制备的影响，每个因素设置5个水平进行单因素试验 2.3 家蝇幼虫蛋白酶解正交试验 在前期单因素试验基础上，以加酶量、底物浓度、时间、温度和pH 5个因素设计正交表L18（37）进行正交试验，见表1 2.4 DPPH自由基清除活性测定 DPPH是一种合成的以氮为中心的稳定自由基，已广泛用于各种提取物或化合物的抗氧化活性评价及筛选工作中。本试验以DPPH自由基清除率为抗氧化活性评价指标，分离并筛选活性组分 取0.1 mmol/L DPPH无水乙醇溶液2mL，与2mL待测样品混匀，室温避光反应30min，在517nm处测得吸光度为Ai；取2 mL待测样品与等体积无水乙醇混合，反应30min，在517nm处测得吸光度