敲除小鼠常见问题及回答.doc

敲除小鼠一、什么是ES细胞显微注射？答：胚胎干细胞显微注射是制作基因敲除小鼠的一个最常用的方法。主要过程是将携带目的基因的胚胎干细胞注射到小鼠的囊胚腔中获得嵌合体小鼠。所得嵌合体小鼠的组织，将同时含有来源于囊胚的细胞和胚胎干细胞。嵌合体小鼠必须和野生型小鼠配种以决定遗传改变的生殖系能否传递，这样可能获得转基因或打靶基因（来源于胚胎干细胞）稳定的生殖系传递的小鼠。一般情况下，大约能获得50%继承了目的基因的后代。 二、嵌合体遗传学上用以指不同遗传性状嵌合或混杂表现的个体。免疫学上的涵义则指一个机体身上有两种或两种以上染色体组成不同的细胞系同时存在,彼此能够耐受,不产生排斥反应,相互间处在嵌合状态。在基因敲除鼠中指通过向囊胚注射被外源基因转化了的胚胎干细胞，使得发育成为的个体中含有不同基因型的细胞，产生的个体也叫嵌合体，即该生物体中嵌合了两种不同遗传结构的细胞（一种是基因型被改变了的细胞，另一种是原来的基因型的细胞）。 三、条件性敲除的原理？答：Cre-LoxP系统是源于P1噬菌体的一个DNA重组体系,由Cre酶和相应的LoxP位点组成,它能导致重组发生在特定的DNA序列处(LoxP位点),该系统可以将外源基因定点整合到染色体上或将特定DNA片段删除。基于Cre-LoxP的基因打靶要分两步来进行。首先要在胚胎干细胞的基因组中引入LoxP序列，这一步可以通过打靶载体的设计和对同源重组子的筛选来实现。下一步通过Cre介导的重组来实现靶基因的遗传修饰或改变。Cre-LoxP系统既可以在细胞水平上用Cre重组酶表达质粒转染中靶细胞，通过识别LoxP位点将抗性标记基因切除，又可以在个体水平上将重组杂合子小鼠与Cre转基因小鼠杂交，筛选子代小鼠就可得到删除外源标记基因的条件性敲除小鼠。 四、如何鉴定和挑选嵌合体？答：动物只有部分组织细胞整合有外源基因，则称为嵌合体动物。它的鉴定主要根据毛色去鉴定。注射的ES和囊胚来源不同的小鼠品系。它们的毛色不同。因此可以根据毛色的嵌合率来鉴定和挑选嵌合体。 五、ROSA26与定点插入？答：利用同源重组技术，把外面的cDNA片段或者其他DNA片段，定点插入到ROSA26位置。ROSA26是一个安全区域，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。 常见问题 目前公司主要提供基因敲除定制化的全程服务，同时也可以承担打靶载体构建、细胞转染和显微注射等服务项目。 2、您公司的C57BL/6 野生型胚胎干细胞株是否可以出售？ C57BL/6 野生型胚胎干细胞株我们是不对外出售的。这个细胞株是我们自主研发并具有自主知识产权的细胞系。鉴于基因敲除工作的重要环节以及是否可以得到一个比较好的Germline transmission的关键就是是否有一个高质量的ES cell line，因此这个ES cell line已经成为我们公司的最核心的资产。所以，非常抱歉！我们不能对外出售，请您谅解！ 3、公司最后提供给客户多少只F1代小鼠？有相关的检测方法或检测报告吗？ 我们最后提供给客户的是不少于两只的F1杂合子小鼠。一般情况下，我们可以提供更多的F1代杂合子小鼠。我们会有相关的检测方法和最终的检测报告提供给您，您也可以自己进行核实检测！也可以在我们的帮助之下完成。 4、客户委托公司制备基因敲除小鼠需要提供哪些材料？ 客户只需要告诉我们要操作的基因名字和您的特殊要求。对于没有经验的客户，我们会免费为您提供咨询，了解您的需求，以及想得到的结果，为您提供最佳的设计方案。我们会对该基因进行序列分析后，给您一个初步的设计，双方沟通没有问题后，我们会签署一份技术服务合同，然后我们进行BAC的订购，开始模型的制备。直到您得到F1代小鼠。 5、公司是否能提供大鼠的基因敲除服务？ 我们公司现在主要是提供各种基因敲除小鼠模型的制备服务。有关基因敲除的大鼠模型，我们公司正在对技术进行研发和优化。所以现在还不能为您提供基因敲除的大鼠，非常抱歉！请关注我们公司的网站。我们一旦开始提供大鼠基因敲除服务，我们将在公司网站上公布（估计在2013年）。 6、公司提供基因敲进服务时，对敲进的基因有哪些要求？所能接受的最大分子量是多少？ 公司提供基因敲进服务时，对于特殊的基因，需要客户提供cDNA信息，插入基因片段的大小一般在5K以下，效果比较好。对于5-10kb的，效率可能会低一些。对于大片段的敲进，由于重组效率将大大地降低，我们可能会收取较多的费用。 7、公司会安排多少个阳性克隆进行囊胚注射？ 我们通常在注射的时候会安排四个克隆，但是我们做阳性重组胚胎干细胞筛选的时候通常要求得到不少于6-8个克隆，以备筛选更好的注射克隆之用。而且，我们的最终目标是要得到优良的Germ-line transmission。 8、公司如何对转染的ESC进行筛选