细胞划痕实验.docVIP

细胞划痕实验很多战友肯定现在都做过关于细胞迁移的实验。其中划痕法以其材料廉价，操作简单而多年来一直深受大家的欢迎。我这里介绍一下我自己的操作过程和结果图。希望能给新来的战友们以帮助。材料：6 孔板（其他的也可以，但感觉6孔比较好，大小适中）marker笔直尺20微升枪头（灭菌）无血清培养基PBS准备：所有能灭菌的器械都要灭菌，直尺和marker笔在操作前紫外照射30min（超净台内）流程：1。先用marker笔在6孔板背后，用直尺比着，均匀得划横线，大约每隔0.5~1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。2。在空中加入约5X105个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。3。第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。4。用PBS洗细胞3次，去处划下的细胞，加入无血清培养基。5。放入37度5%co2培养箱，培养。按0，6，12，24小时取样，拍照。楼主的照片很漂亮但是用六孔板我觉得有些浪费，我们实验室常用的是96孔板，可以同时做很多平行复孔。不知你照片拍完了之后用什么软件统计划痕的宽度呢，我们一般使用共聚焦显微镜自带的软件。你能把统计方法介绍一下吗？ 老实说，我们实验室没有什么好的软件。所以一般只作定性，不作定量。如果楼上有好的软件能否共享一下，不胜感谢。6空板可以保证有相当距离的平直划痕，我觉得挺不错的。而且因为有5条定位线，与划痕相交，这样就有10个可固定监测点，不作重复，误差也很小。 细胞迁移实验是做什么研究的啊，不是很懂 感谢，学到宝贵经验！ 谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。 恩,学习了不少, tacthgin wrote:谢谢楼主，照片很漂亮，实验步骤也很清楚。需要提醒楼主的是：如果你连续监测24小时，你需要考虑到划痕缩小是细胞迁移和细胞繁殖共同作用的结果，而不是单纯的细胞迁移。如果你要单纯的考虑细胞迁移，你可以先用丝裂霉素处理一小时，抑制细胞的分裂，这样你的结果就是细胞迁移的作用了。照片拍完之后，可以用image J 来测量划痕区域的像素定量比较细胞迁移的速度。谢谢。无血清的话，应该一个细胞周期内，增殖可以忽略吧。而且我定点监测的话，差不多可以对应到每个细胞。好像没有看见很明显的增殖现象。丝裂霉素貌似很贵的说。。。如果用这个还不如直接用transwell呢。另，image J 哪里有下载么？谢谢。 ImageJ 下载网址：/ij/download.html 无血清培养，确实细胞增殖可以忽略了，不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢？你这不是“又叫马儿跑，又叫马儿不吃草么“。呵呵 tacthgin wrote:ImageJ 下载网址：/ij/download.html 无血清培养，确实细胞增殖可以忽略了，不过由于细胞内信号传导系统整体性的下调节，细胞迁移的速度也会慢很多。不知道是不是大多数文献都用无血清培养状态下作划痕实验呢？你这不是“又叫马儿跑，又叫马儿不吃草么“。呵呵谢谢，tacthgin战友的提醒，确实存在这个问题。所以目前最好的方法还是transwell法。一般做划痕实验，都是无血清或者低血清（《2%）否则细胞增殖就不能忽略。一般认为细胞周期是24小时，但对于一些特殊的细胞系来说，生长可能会快一点。因此好像还没看见用带血清培养，短时间检测的。不过我会去试试看。可能是个好方法。划痕法的意义在于，价格低廉，操作简单。还有很重要的一点在于细胞外围环境简单单纯，容易控制。（比如做加药的，可能会和血清的组分有反映，而且受血清批次的影响，造成误差。如果是铺了ECM物质的，组分就更复杂了。）划痕法的不足也很明显，适用的细胞系很窄，一般只能用于上皮，纤维样细胞系。因为1。这些细胞本身有迁移能力，且较强。2。细胞有极性，方便测量，观察。3。细胞对无血清有较强的忍受力（至少24小时），因此很多肿瘤细胞系是不适合做划痕的，很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12小时细胞凋亡就超过50%。这也就是transwell发展的最大要求。而一些上皮样细胞系甚至可以忍受高达72小时的无血清实验。足以弥合划痕。另：在此贴出的图片都是本人实验数据，非将本人同意不得转载，引用。如需要引用者，请同本人联系