毕业答辩wq05202.ppt

* 博士研究生活是单调的，非常感谢罗老师为我们提供了一个舒心的科研环境。感谢老师积极鼓励我们出去开展一些学术交流活动和很多室外交流活动。再次表示感谢！ * （1）sulI 和 intI 基因绝对含量随离子液体[BMIm][PF6]浓度的增加而增加。intI和 sulI 的含量显著地增加2-3个数量级。由此可知，离子液体[BMIm][PF6]作为一种环境选择性压力增强了抗性基因sulI 和 intI的传播和扩散。 （2）另外，我们发现sulII仅增加22倍。这说明磺胺类抗性基因sulI 和sulII在环境中的存在和传播的机理存在差异。那么，是什么原因导致这个差异呢？ * （1）对此，我们考察了，基因sulI 与intI 的绝对含量相关性。发现他们具有很好的正相关性。同时，我们通过DNA测序发现基因sulI 序列片段位于I类整合子的3′ 片段区域。这说明磺胺类抗性基因sulI 在微宇宙环境水样中的传播扩散主要是I 类整合子含量增加引起的。 （2）另外，基因sulII 与intI 的绝对含量没有相关性，这也意味着胺类抗性基因sulII 在微宇宙环境水样中的传播扩散与I 类整合子介导抗性基因无关。 ? * (1)我们得到了土著环境菌水平转移的结果，发现实验组水平转移频率是空白对照组水平转移频率的88倍. (2)同时，从0-0.5g/L 浓度范围内，离子液体[BMIm][PF6] 对供体和受体的生长没有影响。这说明了离子液体[BMIm][PF6] 促进I类整合子介导的抗性基因的传播不是由于增加的细菌浓度（细菌生长）引起的。 * 这部分研究内容再加上后面的一点机理，我们的研究成果发表在了ESTL上。 * * 从表可以看出，DNA样品的OD260/OD280值和OD260/OD230，提取的总基因组DNA纯度较高，完全满足后续实验的要求。 * （1）质粒RP4水平转移频率随离子液体[BMIm][PF6]浓度的增加而增加，在1.0 g/L达到最大值，比对照组的水平转移频率增强约60倍。 （2）离子液体[BMIm][PF6]处理过程中，质粒RP4水平转移增强并达到稳定值是在16 h。 * （1）在微宇宙水平转移中，接种供体菌后，在水平转移的初期阶段可培养的供体菌含量会降低。结合实验组和对照组的结果可以看出，供体菌的减少不是离子液体 [BMIm][PF6] 毒理导致的，这可能是因为新接种的供体菌需要适应微宇宙体系中土著细菌群落的新环境，因此在达到稳定之前含量会减少。 （2）另外，可培养的土著细菌群落的生长在实验组和对照组没有差异。说明1.0 g/L [BMIm][PF6]对微宇宙体系中细菌总量的生长没有影响。 * （1）在离子液体[BMIm][PF6]暴露下，用traF基因追踪质粒RP4在水平转移过程中的过程。在本研究中，质粒RP4上卡那霉素抗性基因aphA基因含量的增加与RP4的指示基因traF基因增加的趋势一致。并且，他们的相对含量呈正相关, 。这一结果说明微宇宙体系中抗性基因aphA的传播扩散是由离子液体[BMIm][PF6]促进质粒RP4的水平转移引起的。 （2）本研究充分阐明了离子液体[BMIm][PF6]通过促进质粒RP4介导的水平传播来增强抗生素抗性基因在水环境中的传播。 * 筛选到的接合转化子进行分离纯化培养后，通过对质粒RP4长度比对和RP4上特定基因traF进行PCR鉴定。发现质粒PCR的确发生了转移。 * （1）筛选到的可培养的接合转化子包括6个属的24种土著菌。 （2）另外，筛选到了24株可培养的土著接合转化子中22株是革兰氏阴性菌。与下表原始环境土著菌群相比，说明革兰氏阴性菌更容易通过水平转移获得质粒RP4。 （3）尤其值得注意的是，筛选的可培养接合转化子中，有两株条件致病菌Acinetobacter spp. 和 Salmonella spp.，而且他们都是革兰氏阴性菌，这也增加了抗生素抗性基因向人类致病菌传播的风险。 * （1）为探索离子液体[BMIm][PF6]促进质粒RP4水平转移的机理，利用流式细胞仪定量检测离子液体[BMIm][PF6]暴露下，环境水样土著受体菌细胞膜通透性的变化情况。 （2）结果发现，PI阳性细胞（细胞膜通透性增强的细胞）百分比随着离子液体[BMIm][PF6] 的增加而增加，这表明在0.001-1.0 g/L浓度范围内，细菌细胞膜通透性随离子液体 [BMIm][PF6]浓度的增加而增强。 （3）细菌细胞膜也是同属或跨属之间，细菌通过水平转移进行基因交换的重要阻碍。增强细胞膜通透性会减低细胞膜的阻碍作用，从而增强抗生素抗性基因在环境土著菌之间的传播。 * * 这部分相应的成果发表在PLOS ONE上。 * * 接下来，我们从细胞水平、mRNA表达水平和蛋白表达水平进行了机理研究。 *