第7章性质与分离纯化2010.ppt

一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质分子的大小与形状 三、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 四、蛋白质分离纯化的一般原则 五、蛋白质的分离纯化方法 六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定 本 章 重 点 蛋白质分离基于蛋白质的哪些性质？ 主要纯化方法的原理？ 大概能够针对蛋白质的性质的差异设计相应的实验方案对蛋白质进行分离 二、蛋白质分子的大小和形状 （一）根据化学组成 （二）渗透压法 （三）蛋白质的扩散和扩散系数 （四）沉降分析法 （五）凝胶过滤法 （六）SDS(一）根据化学组成测定 用化学的方法测定出蛋白质中某一微量元素的含量,并假设蛋白质分子中只含有一个该原子,则可以换算出蛋白质的最低相对分子质量: 元素的原子量 元素的百分含量 （五）凝胶过滤法测定相对分子质量 Note： 蛋白质分子通过凝胶柱的速度并不直接取决于分子质量，而是分子的半径。 因此用凝胶过滤法测定分子质量，标准蛋白质（已知Mr）与待测蛋白质必须具有相同的分子形状（球形） 分子形状为线形或能与凝胶发生吸附作用的蛋白质，不能用此法测定。 优点： 设备简单，不要求复杂的仪器 对待测样品的纯度要求不高。待测样品可以是不纯的，只要他具有专一的生物活性。 聚丙烯酰胺凝胶：具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状） 方法：①用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，形成 SDS-蛋白质复合物，使得不同蛋白质分子均带 负电（SDS带负电），且荷质比相同； 不同蛋白质分子具有相似的构象。 ②用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们 的迁移率作图 ③测出待测样品的迁移率 ④从标准曲线上查出样品的相对分子质量 分子量测定 （5）加热变性 几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全，最迅速？？ 蛋白质天然结构解体，疏水基外露，破坏了蛋白质的水化层 破坏电荷情况 五 蛋白质的分离纯化方法 （一）根据分子大小不同的纯化方法 不同分子量的蛋白质分子 1 透析和超滤 超滤装置 2 密度梯度离心 3 凝胶过滤 凝胶的网孔大小决定分离范围 能被该凝胶分离开来的蛋白质混合物的相对分子质量范围 Sephadex G-50 1 500~30 000 以甲叉双丙烯酰胺为交联剂，将丙烯酰胺（单体）聚合而成 (2)凝胶过滤的原理 （二）根据溶解度差别纯化的方法 1. 等电点沉淀和pH控制 2. 盐溶和盐析 盐溶原理示意图 盐析原理示意图 应用 3. 有机溶剂分级法 有机溶剂分级分离原理示意图 4 温度对溶解度的影响 电泳的发展 a. 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 b. 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。 1）纸电泳：用滤纸作支持物。 2）凝胶电泳：用凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）作支持物。 纯化中应用最多的是聚丙烯酰胺凝胶电泳和等电聚焦电泳，它们既可以作为蛋白质纯度检验方法，也可以纯化、制备蛋白质。 （2）等电点聚焦 （3）双向凝胶电泳 2.离子交换层析法 不同载体： 离子交换纤维素 离子交换交联葡聚糖：兼有分子筛效应 离子交换交联琼脂糖 离子交换剂的构成 纤维素－O-CH2－COO-－Na+ DEAE anion exchanger CMC Cation Exchanger （四）根据选择性吸附的差异：吸附层析法 吸附剂： 极性：硅胶、氧化铝、岩藻土（离子吸引和氢键） 非极性：活性炭（范德华力、疏水作用） （1）吸附层析 最广泛最有效：羟基磷灰石（hydroxyapatite)，即结晶磷酸钙[Ca10（PO4）6（OH）2]， 用途：可分离蛋白质、核酸，与DNA的亲和力最高 （2）疏水层析（HIC) 层析介质：苯基琼脂糖（phenyl-sephadex) 辛基琼脂糖(octa-sephadex)