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第十二章 基因诊断Gene Diagnosis ㈠ 核酸分子杂交 一、遗传性疾病基因诊断的策略 直接诊断 点突变 间接诊断 多态性连锁分析 镰刀型红细胞贫血症： 第六位密码由GAG突变成GTG 感染性疾病基因诊断的策略： 针对病原体特异的核酸序列设计探针进行杂交 应用PCR技术扩增病原体基因保守序列 核酸杂交技术与PCR技术联合应用 二、肿瘤相关基因的检测 ㈠ras癌基因的检测 ras基因中最常见的点突变是第12，13或61密码子突变 检测方法： PCR-SSCP PCR PCR/ASO ㈡ p53的检测 p53基因突变主要为点突变，热点区域位于密码子130~290 检测方法： PCR—SSCP PCR—测序 PCR—RFLP 针对重复序列人工合成寡核苷酸短片段作为探针，与经过酶切的人基因组DNA进行Southren印迹杂交，可以得到大小不等的杂交带，而且杂交带的数目和分子量大小具有个体特异性，就像人的指纹一样，因而称之为DNA指纹。 第五节 基因诊断在法医学上的应用 人类个体多样性和个性取决于基因组DNA核苷酸序列的差异，其中微卫星DNA和小卫星DNA等是重要的多态性标志。不同个体间重复单位数目不同。致使 RFLP和PCR分析得到的序列长度不同。 * * 基因诊断的概念 用分子生物学的理论和技术，通过直接探查在基因存在状态，从基因结构、定位、复制、转录或翻译水平分析基因功能，从而对人体状态和疾病作出诊断的方法。 检测目标分子是DNA或RNA，反映基因的结构和功能，检测基因有内源性基因和外源性基因。 第一节 基因诊断的技术和方法 基因诊断的特点 高特异性； 高灵敏度； 早期诊断性； 应用的广泛性； 制备样品 制备探针 杂交 检测 获得满意的高特异性杂交的关键是控制好杂交条件和杂交后冲洗条件 二、 基因诊断常用的分子生物学技术 （二）PCR PCR是在试管内利用DNA聚合酶催化的反应反复进行同一段DNA片段合成的过程。 PCR在基因诊断中的作用 从极少样品即可扩增出肉眼可见的产物。 放大待诊信号，提高检测灵敏度 ㈢ SSCP DNA→酶切→Southern杂交分析 DNA→PCR →酶切→电泳分析 ㈣ 限制酶酶谱分析 ㈤ SNP 变性高效液相色谱(DHPLC)是一种高效、准确、经济的检测SNP的技术，因其检测SNP的高灵敏度、低成本以及全自动化操作等优点而备受关注。 PCR扩增包含SNP位点的片段，变性后缓慢复性。样品为杂合子时，出现4各组分：两个同源双链和两个异源杂合双链。 病例SOX9基因HMG box内发生单碱基置换突变R178L(G→T)，如图2所示，左侧正常对照第225位碱基为C，而该患儿为A（反义链中） 例：序列分析用于基因诊断研究 （六）DNA序列测定：直接、准确 生物芯片（biochip)技术： 根据生物分子间特异性相互作用，将生化分析过程集成于芯片表面，从而实现对DNA、RNA、多肽、蛋白质等各种生物成分的高通量快速检测分析。 三类：诊断芯片；表达谱芯片；检测芯片 （七）生物芯片（biochip) 二、基因诊断技术路线和方法的选择 基因诊断技术途径： ①直接分析致病基因分子结构及表达是否异常的直接诊断途径； ②利用多态性遗传标志与致病基因进行连锁分析的间接诊断途径。 （一）直接诊断途径 直接诊断途径的必要条件 ①被检基因的突变类型与疾病发病有直接的因果关系： ②被检基因的正常分子结构已被确定； ③被检基因突变位点固定而且已知。 β珠蛋白生成障碍性贫血- β珠蛋白基因突变： PCR-RE分析 MaeI CAAG-CTAG 1.点突变： （1）导致特异性限制性内切酶位点改变 1.点突变： （2）无限制性酶切位点改变 PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交及等位基因特异PCR（allele specific PCR，AS-PCR）或称为等位基因特异性扩增（ASA）等技术。PCR-ASO斑点杂交或反向斑点杂交技术可快速、简易地检测已知突变。 ①PCR/ASO 一对探针(正常探针和突变探针各一) 突变碱基置探针中央 控制杂交条件 引物2 突变位点 引物1 5’ ②反向点杂交 引物2 致病基因 引物1 5’ 3’ 引物3 引物4 多重PCR 引物1,2确定有无缺失及缺失片段大小 引物3, 4确定缺失部位 2.大片段丢失或插入的诊断 （1）Southern 印迹杂交、斑点杂交、原位杂交，通过设计一系列相应于缺失区域的核苷酸探针，正常者出现杂交信号，而患者则因缺失这一区域，而检测不到杂交信号 3.基因重排：核酸分子探针杂交与PCR PCR:设计3条引物进行2个PCR反应. 1、正常位点