4蛋白质化学2一级结构及分析.pptxVIP

蛋白质的一级结构及其分析;Peptides and Proteins;肽键就是一个氨基酸的α-羧基与另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的键 ; 氨基酸连接成肽链后，由于氨基酸之间通过一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基缩合脱水，肽链上的一个氨基酸单位被称为残基（residue），带有游离?-氨基的一端被称为氨基（末）端（或N端），带有游离?-羧基的一端被称为羧基（末）端（或C端）。;肽链上的解离特性;生物活性的肽及多肽的大小差异极大;1965年由科学家James?Schlatter在研究蛋白质时发现，经16年100多次的科学研究及验证后，阿斯巴甜于1981年(FDA批准）以Nutrasweet（纽特健康糖）品牌正式推出市面。1986年我国卫生部批准可用于除罐头以外的所有食品中。 ;GSH可被氧化成GSSG GSH作用：在红细胞中作为巯基缓冲剂存在； 维持血红蛋白和其它红细胞蛋白质的半胱氨酸残基处于还原状态。;蛋白质中多肽链的长度差异极大;一些小肽在极低浓度下发挥作用; +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽;鹅膏蕈碱（鹅膏毒素、蝇蕈素）的化学结构;蛋白质可以有不同的多肽亚基;一些蛋白质的两条或多条多肽链是共价连接的;从蛋白质的大小估算氨基酸残基数;;有些蛋白质含有非氨基酸的化学基团;铁蛋白;肽的物理化学性质; 1952年丹麦人Linderstrom-Lang最早提出蛋白质的结构可以分成四个层次: primary structure 一级结构： 氨基酸序列 secondary structure 二级结构： α螺旋，β折叠 tertiary structure 三级结构：所有原子空间位置 quarternary structure 四级结构： 蛋白质多聚体 1969年正式将一级结构定义为氨基酸序列和二硫键的位置。 介于二级结构和三级结构之间还存在超二级结构（二级结构的组合）和结构域（在空间上相对独立的三维结构的实体）这两个层次。 ;肽键将氨基酸与氨基酸头尾相连;肽 键;肽键平面;两个肽平面以一个Cα为中心发生旋转;二面角(Dihedral Angle);研究蛋白质的一级结构，就是要将氨基酸的排列顺序搞清楚。 二十世纪四十年代起，许多人不遗余力地从事蛋白质的一级结构研究，Sanger第一个将一个蛋白质（胰岛素）的所有氨基酸的排列顺序通过高度的实验技巧加以确定。;蛋白质一级结构的测定;历史上第一个被确定氨基酸序列的肽（蛋白质）胰岛素insulin;胰岛素的历史 第一个生化药物;科学怪才 Fredrick Sanger;Sanger试剂(FDNB)标记N末端;ABCDE ↓ *ABCDE ↓ *A，*AB，*ABC，*ABCD，*ABCDE ↓ *A,*A+B,… … *A+B+C+D+E ↓ *A,*A+*B,… … *A+*B+*C+*D+*E 1 2 3 4 5 结论：A B C D E;纸层析、薄层层析帮助确定氨基酸种类;最终靠重叠法确定整个肽链;历史上第一个被确定氨基酸序列的酶（1960年）核糖核酸酶ribonuclease, 124 AA;Moore Stein;全自动氨基酸分析仪;蛋白质一级结构的经典分析方法;1. 样品必需纯（ 97%以上）； 2. 测定蛋白质的分子量； 3. 测定蛋白质由几个亚基组成； 4. 测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 5. 测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。;蛋白质和多肽氨基酸顺序的测定;测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比。;多肽链的拆分;测定蛋白质分子中多肽链的数目;蛋白质的酸水解;蛋白质的碱水解;蛋白质的酶法水解;;胰蛋白酶（trypsin）;胃蛋白酶（pepsin）;糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）;嗜热菌蛋白酶（thermolysin);肽键的专一性水解(化学法); （2）NH2OH（羟胺）断裂： 较专一性断裂Asn-Gly之间的肽键 Asn-Leu及Asn-Ala键也能部分断裂 ;末端氨基酸的测定;二硫键的断裂;二硫键的切割与保护;巯基（-SH）的保护;多肽链断裂成多个肽段;测定每个肽段的氨基酸顺序;肽段的的分离纯化： 凝胶过滤、凝胶电泳和HPLC法。;一级结构分析的经典三步