原位杂交protocol.pdfVIP

原位所需试剂用 dH2O配置，溶液高压灭菌 40min即可。 材料固定 材料放入固定液中，抽真空 1hr 至材料完全浸末到固定中，更换新的固定液，室温放置 3~6hr 。 Fixative ：4% paraformaldehyde, 0.25% glutaraldehyde (EM grade), 2.5ml 10XBuffer, 12.5ml distilled water, pH 7.2~7.4 Check pH 10% paraformaldehyde: 10 grams paraformaldhyde in ~70ml distilled water. Add 1 drop of 10N NaOH to stimulate solving and place for 20min at 70℃ (in waterbath).Adjust pH to 6.8 and volume to 100ml. (Solution can be stored in the dark at 4 ℃ up to one month) 10XBuffer=100mM sodium Phosphate pH 6.8 supplemented with 1M NaCl 68.4ml 0.1M Na2HPO4 31.6ml 0.1M NaH2PO4 5.84g NaCl 脱水、浸蜡 1) Remove fixative and pass through the following dehydration steps: - 1X Buffer, H2O,10% ethanol, 30% ethanol, 50% ethanol, 70% ethanol, 80% ethanol, 90% ethanol and 96% ethanol for 20min; 100% ethanol for 3X1h a 2) Remove ethanol and replace subsequently with xylene: - 1:3, 1:1, 3:1 ethanol:xylene; 2X100% xylene, 60min for each step k 3) Overlay xylene with molten paraffin. 3:1, 1:1, 1:3 xylene:paraffin, for two days at 60℃.100% paraffin for two days, and be replaced at least 4 times - 石蜡在脱水前要置于 60℃融化，过夜。 a - Transfer the vials to 60℃ and pour off the paraffin-xylene solution quickly. 包埋 适量 60℃的石蜡放入预热的锡箔纸模具中，在石蜡的中的材料倒入其中。用解剖针和镊子 K 摆好材料的方向。模具放入冰上，待石蜡凝固后，4 ℃保存。 以上过程需要时间为一周左右。在此过程中，材料在固定液、100% 乙醇、以及3：1 的二甲 苯和石蜡的混合液中可以过夜。浸蜡过程需要 4-5 天时间。 准备 1.5mlEp 管，DEPC 处理的枪头，dH2O ，DEPC 水 100ml，1M Tris-HCl pH8.0 Preparation of sildes （需要 2 天时间） 1) 盖玻片、载玻片的处理 - 洗洁精清洗载玻片（100 片）和盖玻片（300 片），自来水缓慢水流冲洗 2hr ，10%HCl 浸泡过夜。市售盐酸浓度为 36% 。 - 载玻片装入提篮中，流水冲洗 2hr ，晾干。盖玻片流水冲洗2hr ，100%乙醇漂洗，100% 丙酮 dip，晾干。锡箔纸包好载玻片和盖玻片，180℃烘烤 3hr 。 2) 载玻片放入含有 100ug/ml poly-L-lysine (sigma) solution in 10mM Tris-HCl for at least 10min. Sl