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质粒提取及双酶切鉴定 2011年5月9日 主要内容 一、实验目的及原理 学习和掌握碱裂解法提取质粒的方法 学习和掌握双酶切鉴定 二、实验原理 （一）质粒提取原理 质粒(Plasmid) ： 独立于染色体外的，能自主复制且稳定遗传的遗传因子，是一种环状的双链DNA分子。 存在于细菌、放线菌、真菌以及一些动植物细胞中，在细菌细胞中最多。 本实验采用SDS（十二烷基硫酸钠）碱裂解法提取质粒DNA。将细菌悬浮液暴露于高pH值的强阴离子洗涤剂中，会使细胞壁破裂，染色体DNA和蛋白质变性，将质粒DNA释放到上清中。在裂解过程中，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，被十二烷基硫酸盐包盖。当用K+取代Na＋时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。 （二）双酶切原理 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）是一类能识别双链ＤＮＡ中特定碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中发现。 根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类，我们这里用到的是Ⅱ型。 Ⅱ型限制性内切酶它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，产生特异的ＤＮＡ片段。 如EcoRI的识别顺序为： 5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G …… 5’ 在双链上交错切割的位置切割后生成 5’……G AATTC……3’ 3’……CTTAA G……5’ 三、实验材料与试剂 （一）材料 大肠杆菌DH5α（含有携带插入片段gcp的质粒PMD19-T） 三、实验材料与试剂 （二）试剂 (1)溶液Ⅰ: Tris·HCl(pH8.0) 25mmol/L EDTA(pH8.0) 10mmol/L 葡萄糖 50mmol/L (2)溶液Ⅱ(新鲜配制) : NaOH 0.2mol/L SDS 1%(W/V) (3)溶液Ⅲ(100ml): 5mol/L乙酸钾 60ml 冰乙酸 11.5ml(pH4.8) 水 28.5ml (4) 苯酚 (5) 氯仿：异戊醇（24:1） (6) 无水乙醇、70%乙醇、醋酸钠（pH5.2） （三）限制性内切酶 1）EcoRI 识别顺序为：5’…… G|AATTC ……3’ 3’…… CTTAA|G ……5’ 2）XhoI 识别顺序为：5’…… C|TCGAG ……3’ 3’…… GAGCT|C ……5’ 四、实验步骤 (一) 质粒提取 1. 挑转化后的单菌落接种到含有适当抗生素(Amp)的LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜。 2. 将1ml的培养物倒入1.5ml的EP管中, 4℃、12000rpm离心1min。弃去培养液，使细菌沉淀尽可能干燥。 3. 将细菌沉淀重悬于100μl冰预冷的溶液Ⅰ中, 吹打沉淀至完全混匀(无块状悬浮)。 4. 加200μl新配制的溶液Ⅱ,立即温和颠倒离心管5次，使菌体充分裂解, 切勿振荡!将离心管放置于冰上1-2min。(不要超过2min)。 5. 加150μl用冰预冷的溶液III, 反复温和颠倒5次, 将管置于冰上3～5min。 6. 4 ℃、12000rpm离心15min,将上清液约400ul转移到另一离心管中。 7. 加1/2体积的苯酚，1/2体积的氯仿：异戊醇（24:1）振荡混匀。 4 ℃、12000rpm离心10min，将上清液约400ul转移到另一离心管中。 8. 加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的醋酸钠沉淀质粒DNA,振荡混匀,于－20 ℃放置15min。 9.4 ℃、12000rpm离心5min。小心除去上清液，将附于管壁的液滴除尽。 10. 加1ml 70％乙醇溶液洗涤沉淀，4 ℃、12000rpm离心5min。弃去上清液，在空气中使DNA沉淀干燥。 11. 用20μl灭菌的蒸馏水溶解DNA,加1μl胰RNA酶消化RNA 30min。 （二）双酶切及电泳检测 双酶切体系（20ul）： 质粒 7ul EcoRI 1.5ul XhoI