【2017年整理】6电穿孔方法向活体动物导入外源基因.doc

实验六、电穿孔方法向活体动物导入外源基因 引言：,活体电穿孔法基因导入和表达效率较高,它的特点主要在以下几个方面:首先,在外源基因导入的靶器官的选择方面,理论上任何组织和器官都可以作为活体电穿孔的靶器官,在考虑到靶器官组织生理特性的基础上,如果所选择的局部组织细胞不能把所转移基因的表达产物分泌到外周血液循环中,则在某种意义上说已失去了基因导入的价值,这在基因治疗中是关键性的问题。活体电穿孔法对导入的外源基因片段的大小没有限制,从几kb 或十几kb 的表达载体, 到100～200kb 的YAC、BAC 基因组,都有成功导入并获得表达的报道[5 ] 。此外活体电穿孔法操作简单快速,电穿孔的时间只有几秒钟,而且DNA 片段不需要特殊的纯化操作。但电穿孔法也存在难以避免的缺点:首先,外源基因表达持续的时间很短。其次,活体电穿孔法与应用病毒载体法相比外源基因表达效率仍偏低。 电穿孔时在能量导入一定的情况下设计施加电压的值。电压过低或过高都会影响外源基因的表达。电压过低时,无法造成细胞膜表面状态的改变,因而外源DNA 不能进入细胞内。电压过高时,局部组织积聚过多热量,造成细胞的死亡或组织失去功能,即使外源基因导入细胞,也无法进行正常的表达。哺乳动物常用的活体电压大多为20～100V/cm ,最高电压在250～750V/cm。 由于电穿孔瞬间在局部会产生大量热,因此操作过程中,DNA 转染试剂应保持4 ℃,同时电穿孔操作部位的温度也应适当降低。此外在电穿孔操作部位温度降低的同时可以有效抑制局部组织的出血和外源DNA 的流失,这样也在一定程度上保证了基因的导入效率。 1 材料方法 1.1 材料 实验室购买的金鱼、真核表达质粒pCMV/β-gal。实验在北京市北京科技大学理化楼120进行。 1.2 试剂 鱼安定溶液、PBS溶液、固定液、洗液1、洗液2、染液。 1.3 方法 1.3.1 电穿孔法转染质粒 称取50mg鱼安定溶于100ml水中，制成麻醉液。将鱼放入麻醉液中麻醉，待鱼运动缓慢且无规则时取出。用PBS清洗微量注射器针头，再用微量注射器将10μl质粒溶液打入鱼头部隆起的中，立即将电击器在注入质粒pCMV/β-gal处贴鱼电击（两电极间应不产生电火花）几次。将电击后的金鱼放回清水中，待鱼清醒后，更换一次清水，培养一天（水中用供氧器提供氧气）。 1.3.2 转染细胞染色 将鱼去头处死，取少量电击部位的和其余分别置于离心管中，小心滴加1ml固定液，室温静置10-15min，然后吸除固定液，加入1ml洗液1，轻轻晃动，室温静置5min，然后吸除洗液1，再加入1ml洗液1，50℃水浴1小时；吸出洗液1，再加入1ml洗液2，轻轻晃动，室温静置5min，然后吸除洗液2。加入1ml染液，37℃静置24h1.3.2 观察（第三天） 压片、用光学显微镜观察细胞颜色。 2 结果与 参考文献：陈英，庄延，活体电穿孔法基因导入技术，中国生物工程杂志，2003.5（23）104-106 附 录 药品的配置表 名称 配制方法 PBS缓冲液 分装，121 ℃灭菌20 min。 0.1 M铁氰化钾储液 1.646g铁氰化钾加入50mlPBS溶液121 ℃灭菌20 min。 0.1 M亚铁氰化钾储液 2.112g亚铁氰化加入50mlPBS溶液121 ℃灭菌20 min。 1 M七水硫酸镁储液 12.323 g七水硫酸镁加入50ml121 ℃灭菌20 min 固定液 1×PBS（已灭菌），2％甲醛，0.2％戊二醛，2mM Mg2＋ 洗液1 1×PBS（已灭菌），2mM Mg2＋ 洗液2 1×PBS（已灭菌），2mM Mg2＋，5mM 亚铁氰化钾，5mM 铁氰化钾 100mg/ml -gal储液 用N，N-二甲基甲酰胺1ml100mg X-gal，避光保存，无需灭菌 染液 在洗液2-gal储液至终浓度0.2mg/ml 1