棉花害虫防治新靶标漆酶基因的初步研究.pdfVIP

摘 要 摘 要 Laccase 漆酶 （ ）是一种结合有三个铜离子的蓝色多铜氧化酶，可以从各种有机底物 4 上催化转移 个自由电子使氧气还原为水。漆酶主要催化一个通过电子转移发生的氧化 还原反应过程。棉铃虫是一种夜蛾科昆虫，为全世界最重要的农业害虫之一，在世界各 棉区均有分布，主要危害棉花、玉米、高粱等多种农作物。漆酶在棉铃虫表皮形成和鞣 化过程中起着关键作用，可以做为新型害虫抑制剂的靶标酶，而且漆酶在工业上极具应 用价值。因此，棉铃虫的漆酶基因成为研究棉铃虫的重要研究对象。本文首先克隆出棉 铃虫漆酶基因并对其进行生物学分析。主要包括以下几个方面： 1 cDNA PCR （）以棉铃虫 为模板，设计特定引物进行 扩增，将目的基因片段连接 到pUCm-T载体，成功地克隆出了棉铃虫漆酶基因。测得cDNA序列长为2280bp，含 有完整的开放式阅读框。去除信号肽编序列码后的实际克隆序列长为2211bp，编码737 个氨基酸。 2 （）通过生物信息学对测序结果进行分析，棉铃虫漆酶基因与其它鳞翅目昆虫的 漆酶基因有较高同源性。同时对漆酶的蛋白质结构做出分析。棉铃虫漆酶二级结构中α 1.22% β 22.93% 75.85% 螺旋占 ， 折叠占 ，圈环和其它随机结构占 。 3 Xcm pET17ba （）本实验验证了一个基因定向克隆的使用方法。通过 Ⅰ对 进行酶 3’ C T 切，得到线性化的定向克隆载体，该载体两个末端的 端分别突出一个 和一个 碱 基。测试分析表明，可保证PCR产物直接定向克隆于表达载体。通过该方法将前面克 隆得到的laccase基因产物进行连接，转化，成功构建漆酶的原核表达载体。所提出的 新定向克隆方法，提高了重组载体的构建的工作效率，可降低实验成本。测序分析表明 通过上述方法构建的Laccase基因载体正确。 关键词： 棉铃虫 漆酶 基因克隆 序列分析 载体构建 原核表达 I Abstract Abstract Laccases have three Cu-oxidase domains in polyphenol oxidase, which catalyze the oxidationofavastarrayofaromaticsubstratesalongwiththereductionofmolecularoxygen to water. The mechanism of catalytic reaction is a process of oxidation and reduction by electrontransfer. It has been reported that laccasesplay an importantrole in cuticle tanning (or sclerotization andpigmentation) for insects growth. The enzymes can be used for many industrial,environmental,diagnostic,andsyntheticuses.Theresultsareasfollows. (1) With the specific primers we amplified the target fragment of the laccase gene in H