江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用.pdfVIP

1 材料 34 1.1 蛇毒 34 1.2 试剂 34 1.3 仪器 34 2 实验方法 35 2.1 实验动物分组 35 2.2 小鼠局灶性脑缺血/再灌注模型的制备 35 2.3 小鼠脑组织匀浆制备 35 2.4 小鼠脑组织蛋白含量测定 36 2.5 脑组织 SOD 活性测定 36 2.6 脑组织 MDA 含量测定 37 2.7 脑组织 P-Akt 表达水平检测38 3 实验结果 40 3.1 江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对大脑中动脉栓塞/再灌注小鼠脑组织 SOD 活性及 MDA 含量 40 3.2 江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对大脑中动脉栓塞/再灌注小鼠脑组织 p-Akt 表达水平的影响 40 4 讨论 42 五、 结论 43 参考文献 44 致谢 49 综述 50 4 中文摘要 以雄性健康昆明种小鼠为研究对象，采用线栓法建立脑缺血再灌注模型， 研究江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂（Gloydius brevicaudus venom plasminogen activator, GBV-PA ）预处理后对小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的保护作用，以 GBV-PA 干预后梗死体积、神经功能缺损评分、及脑组织 SOD、MDA 含量为评 价指标，同时观察 PI3K/AKT 信号通路与 GBV-PA 缺血再灌注损伤保护作用之间 的关系。 一、 线栓法制备小鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型 参照Longa和Koizumi等[1, 2] 的线栓法制作MCAO模型，健康昆明种雄性小鼠 16只，体重25-28g ，随机分为假手术组和缺血再灌注模型组，每组8只。缺血再 灌注模型组先用线栓堵住小鼠右侧大脑中动脉血供2h ，再拔除线栓至CCA （Common carotid artery ）使MCA(Middle cerebral artery)恢复血供，24h 后采用 Longa评分法进行神经功能缺失的评分、TTC染色法测定小鼠脑梗死体积，假手 术组除不插入线栓，操作方法同缺血再灌注模型组。结果缺血再灌注模型组小鼠 有明显的神经功能缺失症状，主要表现为不同程度地转圈、扭体(前肢及头可触 及后肢) 、行走倾倒及甚至昏迷。缺血再灌注模型组与假手术组相比，Longa神经 评分明显升高（P0.01 ），具有显著性差异，TTC染色可见明显梗死灶，模型复 制成功。 二、 江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂对小鼠实验性脑血栓的溶栓作用 [3] 根据福建医科大学蛇毒所分离纯化江浙短尾蝮蛇毒纤溶酶原激活剂 ，其工 艺如下：GBV→Benzamidine SepharoseTM 4FF→Superdex G-30→GBV-PA 。 参照Chan及Chen等方法略加修改制作小鼠实验性脑血栓模型[4-6] 。取健康昆 明种小鼠48只，体重25-30g ，随机分为假手术组、模型组、GBV-PA 480，320和 160µg/kg 三个剂量组和尿激酶 1AU/kg 组，共6组，每组8只。采用小鼠实验性 脑血栓模型，研究GBV-PA对小鼠实验性脑血栓的溶栓作用及其减轻脑水肿的作 用。结果GBV-PA 480 ，320和160µg/kg剂量组均能减少梗塞侧伊文思蓝含量， GBV-PA 480，320和160µg/kg剂量组的伊文思蓝含量分别为2.25±0.06 ，2.26±0.10 和2.66±0.08µg/g ，与模型组3.17±0.23µg/g相比有显著性差异（P0.01或P0.05 ）， 说明GBV-PA能减轻小鼠脑血栓的严重程度。GBV-PA 480，320和160µg/kg剂量 5 组脑水肿指数分别为GBV-PA480，320和160µg/kg使实验性脑血栓小鼠的脑水肿 指数由分别降到1.7±1.8 （% ）、1.4±1.2 （% ）、2.7±1.9 （% ），与模型组8.3±5.6 （% ） 相比，具有显著性差异（P0.05 ）, 说明GBV-PA能减轻小鼠梗塞侧