水稻矮秆突变体及其回复体中Ds插入位点与转座行为的分子分析.pdfVIP

水稻矮秆突变体及其回复体中Ds 插入位点与转座行为的分子分析 中文摘要 中文摘要 随着水稻基因组全核苷酸序列测定工作的完成，功能基因组学研究已成为水 稻分子生物学研究的重要内容。构建突变体库是研究水稻功能基因组学的一条重 要途径，常用的突变体库构建方法有物理和化学诱变、插入突变、基因沉默等。 其中，利用 Ac/Ds 系统构建水稻突变体库的方法得到了广泛运用。株高是水稻等 粮食作物一个十分重要的农艺性状，直接影响到农作物的丰产、耐肥和抗倒伏性 能。本研究室经过多年对粳稻品种Dongjin 的Ac/Ds 插入突变株系的栽培，从中筛 选到一株具有Ds 插入且表型矮化的矮秆突变体 （Dwarf mutant ，DM ），经栽培后 出现株高表型部分回复的回复突变体 （Revertant type ，RT ）。本研究对该突变体及 其回复体中Ds 插入位点与转座行为进行了分子分析，取得了以下两个方面的主要 结果。 一、对矮秆突变体进行初步的表型鉴定；基于 TAIL-PCR 技术分离了矮秆突 变体Ds 插入位点的侧翼序列，并利用生物信息学手段，对Ds 标记基因及其编码 蛋白展开分子鉴定，结果显示： 1. 与野生型 （Wild-type ，WT ）相比，矮秆突变体表现为植株矮化，旗叶倾 角扩大，其平均株高45.9 cm （野生型79.0 cm ），旗叶倾角75.6° （野生型25.3°）。 2. 基于TAIL-PCR 技术，从矮秆突变体基因组DNA 中分离克隆到Ds 插入位 点侧翼序列，通过NCBI-BLAST 在线分析显示，Ds 插入在水稻第 3 号染色体上 （BAC 克隆序列OSJNBa0054H04.28，登录号AC106887.3 ）。 3. 此Ds 标记基因包含4 个外显子和3 个内含子，Ds 插入在其第4 外显子上。 该基因编码产物为氧化还原酶，共有549 个氨基酸残基，从第401 到第497 个氨 基酸是一个高度保守的2OG-Fe （II ）氧化还原酶蛋白结构域。 4. 对该氧化还原酶进行分析，BLASTP 寻找同源蛋白，SWISS-MODEL 分析 此蛋白及其关联蛋白的高级结构，发现此蛋白由9 个α-螺旋和13 个β-折叠结构组 成，与一些赤霉素氧化酶（GA3ox 、GA20ox ）具有相似的蛋白空间结构。 以上结果表明，矮秆突变体（DM ）矮化表型源于Ds 元件（4.6 kb ）在氧化 I 中文摘要 水稻矮秆突变体及其回复体中Ds 插入位点与转座行为的分子分析 还原酶基因第4 外显子上的插入。经过分析，推测此基因可能是一个新的编码GA 氧化酶的基因，通过影响GA 的合成来维持水稻的正常株高。 二、对矮秆突变体 （DM ）进行栽培，后代出现株高表型部分回复的回复突变 体（RT ）。对回复突变体进行表型鉴定，同时，基于TAIL-PCR 技术以及利用生物 信息学手段，对其Ds 转座行为和新的插入位点展开分子鉴定，结果显示： 1. 回复突变体的平均株高74.1 cm （野生型79.0 cm ），旗叶倾角44.1° （野生 型25.3°），株高表型部分回复到正常。 2. Ds 以“内切酶模式”转座机制在回复突变体的氧化还原酶基因上发生切离， 并在Ds 原初插入位点残留序列为 “CATCATGA ”的8 bp 转座足迹。 3. 利用生物信息学软件FGENESH 和GeneMark.hmm 分析，发现8 bp 足迹残 留导致氧化还原酶基因第4 外显子被分隔为2 个分别长168 和327 bp 的外显子， 增加 1 个新的内含子 （长83 bp ），且编码产物减少为524 个氨基酸残基。利用软 件DNAMAN 和SWISS-MODEL 分析发现，8 bp 足迹残留后的氧化还原酶在减少 了部分无规卷曲结构的同时多出一个α 螺旋结构。 4. 基于 TAIL-PCR 技术，通过选用不同的简并引物，在回复突变体基因组中 扩增并分离到2 条Ds 转座后新的插入侧翼序列，定位在水稻第2 号染色体（PAC 克隆P0477B05 ，登录号AP005310.3 ）和第6 号染色体上