3种氨肽酶基因在大肠杆菌中的重组表达与比较研究.pdfVIP

2002013，VoL34,No．23 良品科 学 ※生物工程 3种氨肽酶基因在大肠杆菌中的 重组表达与比较研究 张 洁。，张 梁 ，黄武宁 ，石贵阳 术 (1．粮食发酵工艺与技术国家工程实验室，工业生物技术教育部重点实验室，江南大学，江苏 无锡 2141221 2．义乌市海之纳生物工程有限公司，浙江 义乌 322006) 摘 要：PCR扩增Bacilluslichenfiormis14580、Bacillussubtil~168、GeobacillusstearothermophilusIFO12589氨肽酶 基因，分别酶切连接表达质粒pET．28a，构建重组表达载体pET28a—BLAP、pET28a．BSAP pET28a．GSAP，酶活力 检测表明3个氨肽酶基因均在大肠杆菌宿主BL21(DE3)qh获得重组表达。进一步对3株重组菌的氨肽酶粗酶液反应条 件进行比较研究，结果表明：重组氨肽酶BSAP与GSAP的粗酶活较高，达到1500U／L以上；BLAP、BSAP、GSAP 粗酶的最适酶反应温度分别为50、75、6O℃，BSAP温度稳定性最好，在30~700C时比较稳定；3种重组氨肽酶的 最适pH值都是9．0，pH值在8．5～9．0时比较稳定；0．1mmol／LCo对酶活有较强的激活作用，BSAP的相对酶活力最 高达到195．6％，其他二价金属离子对酶活均有不同程度的抑制，其qUZn抑制作用最大；重组质粒pET28a—BSAP、 pET28a—GSAP在大肠杆菌中较pET28a—BLAP稳定。 关键词：氨肽酶；重组表达；酶反应 A ComparativeStudyofRecombinantExpressionofThreeAminopeptidasesinEscherichiacoli ZHANG Jie，ZHANG Liang，HUANG Wu．ning，SHIGui—yang， (1．NationalEngineeringLaboratoryforCerealFermentationTechnology，KeyLaboratoryofIndustrialBiotechnology，Ministryof Education，JiangnanUniversity，Wuxi 214122，China；2．YiwuHaizhinaBioengineeringCo．Ltd．，Yiwu 322006，China) Abstract：ThegenesencodingaminopeptidaseGSAP．BSAP andBLAPwererespectivelyamplifiedfrom Geobacillus stearothermophilusIFO12589，Bacillussubtilis168andBacilluslicheniformis14580．TheseamplifiedDNAfragments wereindividuallyinsertedintotheexpressionvectorE colipET一28atoconstructplasmidspET28a—BLAP．pET28a-BSAP andpET28a—GSAP，respectively．Theexpressionofhtesegeneswasconfimr edbyactivityanalysis，na dthentheexpressed enzymeswerecharacterized．TheactivitiesofbothrecombinantBSAPandGSAPwere1500U ／L，whichwerehigherthan thatofBLAP．Theoptimum temperatureswere50，75℃ and60℃ ofrBSAP，GSAP nadBLAP，respectively，andthe optimum pH valueswereall9．0．TheywerestableatpH 8．5—9．0．BSAPwasobviouslyactiv