HIV感染的血清学检测_培训课件.ppt

* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * HIV抗体检测确认试验 * HIV抗体确认试验 确认试验的试剂： 必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、在有效期内的试剂。 确认试验方法： 包括免疫印迹试验(WB)、条带免疫试验(LIATEK HIVⅢ)、放射免疫沉淀试验(RIPA)及免疫荧光试验(IFA)。国内常用的确认试验方法是WB。 * 蛋白印迹实验（WB） ——广泛使用的确认实验 基本原理 HIV全病毒抗原经过聚丙烯酰胺凝胶电泳,将分子量大小不等的HIV抗原蛋白带分离开来,然后再把这些已经分离的不同蛋白带电转移到硝酸纤维素膜上。将此膜切割成条状,每一条硝酸纤维素膜上均含有经电泳分离过的HIV病毒抗原。 * 将待检血清样品加到硝酸纤维素膜上,恒温震荡,使其充分接触反应,血清中若含有抗HIV抗体,就会与膜条上的抗原带相结合。 加入酶偶联的抗人IgG抗体和底物，即可使有反应的抗原-抗体结合带呈现紫褐色,根据出现条带情况判定结果。 * 蛋白质抗原分子经电泳分开 血液中的抗体与抗原反应，形成不同的条带 Western Blot * 方法 加血浆 洗 加酶结合物 (Ab-HRP) 洗 加底物 * 其可检测标本中针对HIV不同抗原的抗体，故被用做确认试剂。 不同的研究机构有不同的判定标准 * WB结果判定标准 无HIV-1特异性条带 ２ENV 或１ENV+p24 CHINA 无条带 1 ENV + p24/p31 FDA（USA） 无条带或只有P17 2 ENV+GAG+POL WHO 阴 性 阳 性 组 织 “不确定”(±)：出现HIV-1特异性条带，但带型不足以 确认阳性，每三个月随访一次，共两次， 仍属可疑，判为阴性 * HIV抗体确认实验结果 a 强阳性对照（HIV-1和HIV-2） b弱阳性对照（HIV-1） c阴性对照 d典型的HIV-2血清阳性反应 a b c d gp160 gp120 p66 p55 p51 gp41 p39 p31 P24 p17 血清对照 HIV-2特异带 * 不确定标本的处理 原因 特异性和非特异性 因素 标本种类，操作技术，感染时 间， 指征把握等 处理 随访（注意一根条带） 保存 * 试验中应注意的问题 严格按照说明书操作和阅读 判断结果典型 带型和颜色；强调env带 非典型 全而淡、一根主要条带、高危人群、不确定，等等 特异性高，但也有漏检 核对、多种、操作技术 * 免疫印迹法（WB，HIV-1/2混合型） HIV-1阳性反应 不确定反应 出现HIV-2指示条带 报告HIV-1阳性 不确定反应 阳性反应 阴性反应 报告阴性 每3个月随访1次，共2次，仍属可疑，则报告阴性；如随访期间HIV抗体出现阳性反应则报告阳性。随访期间可根据需要，检测病毒核酸和或P24抗原，作为辅助诊断。 阴性反应 报告阴性 筛查试验阳性反应样品 报告HIV-2血清学阳性 免疫印迹法（WB，HIV-2） 图2 HIV抗体确认检测流程 * P24抗原检测 * 窗口期 infectivity = 4th gen 3rd gen = = 1st-2nd gen HIV antigen IgM ab IgG ab Detection limit = window 第一/二代试剂检测IgG抗体，第三代试剂检测IgG 、IgM抗体, 第四代试剂同时检测IgG、 IgM抗体和P24抗原使窗口期缩短。 * 窗口期 窗口期的决定因素 初筛试剂质量和测试技术 机体免疫反应 病毒特性 窗口期无法避免 * P24抗原测定 适用范围 HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。 HIV-1阳性母亲所生婴儿的鉴别诊断。 第四代HIV-1抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应， 但HIV-1抗体确认阴性者的诊断。 监测病程进展和抗病毒治疗效果。 * 检测原理 P24抗原的检测通常是采用ELISA夹心法，已知抗体包被固相反应板孔底，加入待测血清，若血清中含有P24抗原则与包被抗体形成抗原-抗体复合物，再加入酶（HRP）标记的HIV-1抗体与抗原结合，加底物显色，在酶标仪上读结果。 * 为了提高检测血清中P24抗原的敏感性，需先将血清中免疫复合物解离后再进行