口蹄疫病毒NMXW99疫苗株VP1基因的克隆与序列分析.pdfVIP

第六扶全国会员代表大会暨第11次学术研讨会 IZl蹄疫病毒NMxw-99疫苗株VP1基因的克隆与序列分析 关平原1，裴志花1，李海念2，鸟日罕2，于富丽2，菊花2，鄣金贵2 (1．内蒙古农业大学动物科学与医学学院，内蒙古呼和浩特010018； 2．内蒙古动物疫病预防与控制中心化验室，内蒙古呼和浩特010010) 摘要：根据已知O型口蹄疫病毒的核酸序列，设计并合成了一对用于扩增VPI基因的引物．提取0型口蹄 疫病毒NMxw-99疫苗株的病毒RN A，经RTPCR法扩增了病毒的VPI基因片段，克隆后通过测序获得其核 苷酸序列并推导出相应的氨基酸序列，将NMxw．99株VPI基因核酸序列及氨基酸序列与其它已知O型口蹄 氨基酸之间，特别是在第130～160氨基酸之间差异明显。 口蹄疫(FootandMouthDisease，FMD)是由口蹄疫病毒(Foot 起牛、羊、猪等偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病，本病传染性极强。对畜牧业危害极大， 是世界各国检疫和防疫的重点对象。被世界动物卫生组织(OIE)列为A类家畜传染病之首。 列分析对口蹄疫的分子流行病学调查、病毒抗原性分析、病毒基因型的分析、病毒的变异及基因工程疫苗 的研究等具有重要的意义B,4I。 毒株，本试验对该疫苗株的VPI基因进行克隆测序并进行序列分析。以期了解该疫苗株VPI基因的序列及 与其它O型口蹄疫病毒VPI基因的关系，为口蹄疫的防治提供理论依据。 1材料与方法 1．1材料 疫病预防与控制中心提供。 1．1．2 O型口蹄疫病毒VPl基因参考序列 O／SAR／19／2000等病毒株参考基因序列均有自GeneBank。 1．1．2主要试剂 Plus 总RNA提取试剂盒、Wizard 抑制剂、dNTPs、x—gaI、IPTG、低熔点琼脂糖等购自Pmmega公司． 小量胶回收试剂盒购自V-gene公司。 1．1．3引物 根据已发表的O型口蹄疫病毒核酸序列应用计算机软件设计引物，引物之间跨度为698个碱基，包括 VPl基因，由大连宝生物公司合成。序列如下； 上游引物：5’GTTGACGCTCGCACGCAGAccACc3’ ． 下游引物：5’GGACTCGACGTCTCCTGCCAACTTGA3 937 牛羊传染病 1．2方法 1．2．1病毒RNA的提取 取病毒培养液按总RNA提取试剂盒提取病毒RNA，直接用于ImPCR。 1．2．3病毒RNA的RT-PCR 1．2．3．1反转录 dNTP2ul，0．IM ， 2小时后，95C作用5分钟，灭活反转录酶。合成的eDNA直接用于PCR 1．2．3．2聚合酶链式反应 仪内进行PCR反应。 ’ 10分钟． 电泳30～50分钟，凝胶成像仪下观察结果。 1．2．4PCR产物回收和纯化 用V-gene小量胶回收试剂盒回收．按说明恬进行PCR产物回收。 1．2．5目的基因产物的连接与转化 1．2．5．1目的基因与pGEM-Teasy质粒载体的连接 在o．5ml的离心管加入5ul连接液。再加入lul 每个离心管中反应总体积为10ul，混匀。在16℃水浴，连接2～3小时。 1．2．5．2大肠杆菌感受态细胞的制备 按分子克隆实验指南中介绍的方法制备感受态细胞¨J。 1．2．5．3质粒DNA的转化 取60ul感受态细胞移至灭菌处理的1．5ml离心管中，加入用于转化的DNA10ul，置冰浴中30分钟． 荡培养45～60分钟(160～225转份)。 1．2．6阳性重纽质粒的筛选 37℃振荡培养6～8个小时。 1．2．7质粒DNAPCR鉴定 用WizardPlusSV小量制备DNA纯化系统从细菌培养液中小量提取质粒。 40