第十章固定化酶与固定化细胞技术.pptVIP

第十章 固定化酶与固定化细胞 固定化酶技术从20世纪60年代发展的，被广泛应用于酿造、食品、医药领域。 广义的固定化酶包括： 固定化辅酶 固定化细胞 固定化细胞器 一般来说，对于一步活两步转化过程用固定化酶较合适；对多步转化，用整细胞。 第一节固定化酶 固定化酶是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。 酶的固定化是将酶与水不溶性载体结合，制备固定化酶的过程。 固定化酶的形状： 颗粒---工业发酵 线条----工业发酵 薄膜---酶电极 酶管---工业生产（机械强度大） 固定化酶的特点 优点：1.可多次使用，且酶的稳定性提高。 2.反应后，酶易与底物和产物分开。 3.反应条件易于控制 。 缺点：1.费用太高。 2. 大分子的底物不易使用。 固定化细胞 将细胞限制或定位于特定空间位置的方法称为细胞固定化技术。被限制或定位于特定空间位置的细胞称为固定化细胞。 特点： 1.??无需进行酶的分离和纯化。 2.??细胞本身含有多酶体系，可催化一系列反应。 3.?酶的辅助因子可以再生，稳定性高。 4.?保持酶的原始状态，酶的回收率高。 5.?抗污染能力强。 一、固定化酶制备的方法 固定化酶的制备方法大致可分为4类：①吸附法； ②共价结合法； ②交联法； ④包埋法。 （一）包埋法 它是一种用物理方法将酶包埋在高聚物内，反应条件温和．并且不改变酶结构的固定化方法。 包埋法又可分为 （1）网格型； （2）微囊型； 1．网格型：材料有聚丙烯酰胺、三醋酸纤维、淀粉、硅胶、血纤维和胶原等。 2．微囊型：悬浮液被包裹在膜内，使酶存于类似细胞的环境中，阻止了酶的脱落。小分子底物则能迅速通过膜与酶作用，产物扩散出来。 （二）吸附法 含酶水溶液和吸附剂接触，经洗涤除去不吸附的酶便能制得固定化酶。 吸附法包括： （1）物理吸附法； （2）离子吸附法； （1）物理吸附法 常用吸附剂： 无机载体：高岭土、膨润土、磷酸钙凝胶、多孔玻璃、氧化铝、硅胶、白土、羧基磷灰石等； 有机载体：淀粉、离子交换树脂、琼脂糖的烷基衍生物等； （2）离子吸附法 酶通过离子键吸附于有离子交换基的载体的固定化方法。 阴离子交换剂： DEAE-纤维素， DEAE-葡萄糖凝胶等 阳离子交换剂： 羧甲基纤维素等 离子吸附法 优点： 1.操作简单； 2.条件温和； 3.回收率高； 缺点： 酶易脱落； 蛋白质在载体上的吸附和解吸与下列因素有关。 1．pH：PH能影响载体蛋白质的电荷，从而影响菌在载体上的吸附。一般情况下，在蛋白质的等电点可以达到最大吸附。 2．盐：一般认为盐阻止吸附，盐也被用来洗脱从低盐溶液中吸附的酶。 盐可以促进蛋白质吸附在惰性支持物上，即称“盐析”吸附。 3. 酶浓度：一般在一定量载体上的吸附，总是随酶浓度的增加而增加，直到饱和。 4．温度：通常随温度升高而增加酶的吸附，但温度升高会造成酶失活的加速。 5．吸附速度：酶在固体支持物上吸附速度比较缓慢, 是由于酶的扩散速度较低所致。 6．载体：影响酶活力的重要因素是载体表面积、多孔度及载体的预处理。 （三）共价结合法 酶蛋白分子上功能团和固相支持物上的反应基团之间形成化学共价键的方法。 功能团: 酶分子N端:α-氨基，ε-氨基． 酶分子C端: 羧基、疏基、羟基、苯环等。 优点： 酶和载体之间的连接很牢固，不会发生酶的脱落，稳定性较好。 缺点: 1.载体的活化或固定化操作比较复杂，反应条件也比较剧烈。 2. 若共价结合包含酶活性中心有关的基团，会导致酶的活力损失。 载体的性质对固定化酶有很大影响： 1.载体应是亲水的，疏水载体与有机溶剂相同的变性影响。 2. 载体也要求有一定的机械强度和稳定性。 3.载体须具备能在温和条件下与酶结合的功能团。 常用的载体包括: 1)天然高分子(纤维素、琼脂糖、淀粉、葡聚糖凝胶、胶原及其衍生物等)， 2)合成高聚物(尼龙、多聚氨基酸等)