酵母双杂试验.docVIP

pGBKT7和pGADT7不要同时转入细胞，要先转入一个，平板培养，挑单菌落做液体培养，再转入另一个质粒，同时转入两个质粒的效率太低。我做的时候转化率很高，从来没有出现过问题，转入第一个质粒（pGBKT7）通常在SD-Trp平板上可以有3000-4000个菌落，再转入pGADT7后，在双选择平板SD-Trp-Leu上至少也可以收获400-500个菌落。需要注意的是，细胞转入pGBKT7后，在-Trp上挑选单菌落做液体培养时，不要用YPD培养液，要用SD-Trp培养液，这样才可以使转化的细胞充分生长。转化实验的条件也很重要，如果你觉得这中间有什么不放心，你可以把protocol发给我看看。我这里AH109长得很好，但实验室在国外，估计没法给你。另外，你说AH109培养不好，是在什么选择平板上？在转完两个质粒以后做实验筛选时，应该先做LacZ和MEL1的显色，再做HIS3，最后做ADE2（因为ADE2的选择是最stringent的）。还有什么问题可以继续问我。1.YPDA配制方法如下：先称好Yeast Extract 和Tryptone ，各10g/L 和20g/L ， 加水885ml/L另外称取葡萄糖20g/L，放入另一个容器内，（如果量不多，也可以用50ml离心管）加水定容至100ml。以上两个瓶子同时灭菌：115摄氏度，20min 。灭菌完后，再混合。最后加入已经过滤除菌的0.2％的ADE储液，15ml/L 。 121° 15min -80°取菌种，划线，30° 培养3天, 表面光滑而湿润，把平板用封口膜封好，4°冰箱保存，防止霉菌污染。 2.设置阴性对照最好用空载体，因为pGBKT7-Lam+pGADT7-T组成的阴性对照，在SD\-Trp-Leu-His 板上是能够生长的，但生长速度要比阳性对照慢好多。而Y187或AH109空菌株，在SD\-Trp-Leu-His 板上不能生长，这说明，阴性对照在三缺板上有背景生长。 常用试剂的配制 (1) Kana ( 50rng/ml)溶液的配制:2.5g卡那霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全 溶解后定容到50 ml, 0.22^011滤膜过滤除菌,-2(rC保存. (2) Amp(100rng/ml)溶液的配制:5g氨节青霉素溶于40 ml双蒸水中,待完全溶 解后定容到50 ml, 0.22^m滤膜过滤除菌,-201保存. (3) 20%葡萄糖溶液的配制:20g葡萄糖溶于40ml去离子水中,待葡萄糖完全溶 解后定容至100ml,在超净工作台中用0.22^011滤膜过滤除菌,4°C保存。 (4) 0.2%腺噪呤半硫酸盐:0.03g腺嘿呤半硫酸盐溶于12ml去离子水中,待完 全溶解后定容至15ml,在超净工作台中用0.22^1111滤膜过滤除菌,4°C保存。 (5) 60%甘油的配制:60ml甘油,加人去离子水,定容到100ml,混匀后,121 °C高温蒸汽灭菌20min,4°C保存。 (6) Tris-乙酸(TAE)的配方: 50X储存液:242g Tris 碱+57.1 ml 冰乙酸+100ml0.5inol/LEDTA(pH8.0) 工作液:40mmol/L Tris-乙酸+lmmol/LEDTA YPD培养基 20g/L Difco peptone lOg/L Yeast extract 20g/L Agar(for plates only) 对于包含腺嚼呤的YPD (YPDA)培养基,每升培养基中可加入15ml0.2%的腺 噪呤半硫酸盐溶液(终浓度为0.003%)。 加水至900 ml,调pH值为6.5,然后高温蒸汽灭菌。待培养基冷却到55°C左右 时加入100ml20%浓度D-葡萄糖溶液至终浓度为2%。 若向YPD或YPDA培养基中加kan等抗生素,可在高温蒸汽灭菌后待培养基冷 却到55°C左右后加入0.2-0.3 ml50mg/ml的kan(终浓度为10-15mg/ml)。 SD培养基 6.7g/L YNB(无氨基酸) 20g/L 琼脂粉(用于固体培养基) 800 ml 双蒸水 100 ml 灭过菌的10X缺失培养基 调pH值到5.8,然后高压蒸汽灭菌。待培养基冷却到55°C左右后再加入3-AT, 放线菌酮素,腺嘿呤或X-a-Gal等。 加入100 ml灭过菌的20%浓度D-葡萄糖溶液至终浓度2%。 酵母菌遗传转化溶液的配制 (1)PEG3350(50%W/V)的配制:取50gPEG3350,加入35ml双蒸水,磁力搅拌到其 溶解,定容到100ml,混勻,用0.45^un滤器过滤除菌,存于灭过菌的容器中,4°C保存。 (2)10XTE:10mM EDTA, 0.1M Tris-HCU周 pH 值为 7.5,高温蒸汽灭菌,4°C保存。 (3)10