一 种细胞因子检测新方法——ELISPoT技术.PDFVIP

维普资讯 动物医学进展 ，2004，25(6)：29—31 ProgressinVeterinaryM edicine 一 种细胞因子检测新方法——ELISPoT技术 张 辉 一，潘志明 ，焦新安 ， (1I扬州大学人兽共患病与免疫学实验室，江苏扬州 225009；2．扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室，江苏扬州 225009) 中圈分类号 ：R446．61 文献标识码 ：A 文章编号 ：1007—5038(2004)06-0029-03 摘 要：抗原特异性细胞毒 T细胞在控制病毒 色，孵育形成斑点。每一个斑点代表一个分泌 CK的细 感染和某些肿瘤中具有重要作用，如何准确地定 胞 。假如预先包被抗原，斑点就代表一个分泌特异性抗 量 、定性抗原特异 的T细胞反应及评价其作用，体的ASC。ELISPOT法不仅可 以获得更多的分泌细 胞因子细胞群的信息，而且能够从单细胞水平评价 CK 是细胞免疫学中的一项重要课题 。ELISPOT技 产物；而 ELISA及 Dot-ELISA仅为半定量的酶免疫学 术是近年来正为众多研 究者所认可的一项通过 检测方法 ，而且主要用于药物及小分子物质的检测。 检测细胞 因子 ，评价 T淋 巴细胞功能和特异性 2 ELISPOT基本操作步骤 的新方法。与其他细胞免疫学方法相 比较 ，该方 ELISPOT试验基本步骤包括 ：①将适量捕获性抗 法特异性强、灵敏度高、能够直接检测分泌细胞 体预先包被于 96孔 ELISPOT板 (Millipore产品)上， 因子细胞，而无需体外扩增 。ELISPOT技术对 用胶带封板并在 4℃孵育过夜 。将板用 PBS洗 3遍， 病毒性疾病和肿瘤的发病机制 以及体 内细胞免 再用含体积比1O 胎牛血清 (FCS)的培养基封闭，室温 疫功能的了解具有重要的意义，也为这些疾病的 下孵育至少 1h。FCS可以封闭所包被抗体的FC受体 细胞免疫治疗提供 了理论依据 。 目前 ，有研究显 以降低非特异性反应 。②将细胞样品，如外周血单核细 示该方法不仅应用于肿瘤免疫及其治疗中，而且 胞 (PBMC)，经纯化的CD8+T细胞或去除某种特异细 在细胞 内感染微生物、自身免疫性疾病发病机 胞群的PBMC，用含 1O FCS的培养基稀释至 5×10‘ ～ 2X10个 ／孔 ，分装于 ELISPOT板孔 中，再加入特异 制、治疗等方面均有 巨大的发展潜力。 的刺激物 ，如多肽或基因表达产物 ，提取的抗原等，阴性 关键词：ELISPOT；细胞毒性 T淋巴细胞；分泌 对照孔中只加入培养基 ，阳性对照孔加入植物血凝索 抗体细胞 (PHA，2~／g／mL)或阳性多肽，37℃，体积 比为 5 近年来，在免疫学领域中，对于疾病以及疫苗研究 CO2培养 24-~48h。③用含体积比0．01 Tween-20的 不仅仅局限于体液免疫应答 ，细胞介导的免疫应答 (cellPBS洗 6次，以弃去细胞，加入生物素化抗细胞因子的 mediatedimmuneresponse，CMI)也逐渐为人们所关 检测抗体 ，孵育 3h。④再洗 6次后 ，加入AKP或HRP 注，而 T细胞在CMI中起关键作用。在研究细胞免疫 标记的链亲和素，室温孵育 3h。⑤用 PBS-Tween-20 应答保护作用及其机理方面，人们常常倾向于传统的酶 再洗 5次 ，加入 BCIP／NBT底物，室温下显色，待出现 联免疫吸附试验 (ELISA)，而作为一项新型的免疫酶 紫色 (AKP和底物 的产物)或红色 (HRP和底物的产 技术——酶联免疫斑点法 (enzyme-linkedimmunospot物)斑点时，即可用立体解剖显微镜或计算机辅助成像 assay，ELISPOT)，是从单细胞水平检测分泌抗体细胞 分析系统计算斑点数 ，并用斑点形成单位 (sfu／L百万 (ASC)或