AS模型兔主动脉平滑肌与骨骼肌中VLDL受体亚型的分布和表达论文.docVIP

　　AS模型兔主动脉平滑肌与骨骼肌中VLDL受体亚型的分布和表达论文 【摘要】 极低密度脂蛋白受体（VLDLR）分为两型，Ⅰ型受体含有胞外O连接糖链结合域，Ⅱ型受体不含O连接糖链结合域。在疾病状态下，某些组织中VLDLR亚型分布发生改变，为了验证VLDLR亚型分布变化是否与机体脂质代谢紊乱有关，运用RTPCR技术对VLDLR亚型在动脉硬化（AS）家兔模型组织中的分布和表达进行研究。研究发现，与正常家兔相比，在AS家兔中.freelamato等人对日本大耳白兔各组织的VLDL受体进行研究，发现VLDLR存在16外显子剪切变异体，于是根据VLDL受体胞外段是否含有Olink糖链结合域分为两种亚型，Ⅰ型受体含有此区域，Ⅱ型受体不含此区域。O连接糖链域的缺失据认为是在受体mRNA成熟过程中不同的选择剪切所致。两种亚型的VLDLR的组织分布并不一致：Ⅰ型受体主要分布于骨骼肌、心肌、脂肪、脑干等组织中；Ⅱ型受体主要分布于肺、脾脏、肾脏、肾上腺、睾丸、卵巢、子宫、大脑、小脑等组织器官和某些病理条件下的组织细胞中。对两种受体的功能研究显示，两种亚型的VLDLR均可与VLDL、RAR结合，Ⅰ型受体摄取VLDL的能力与稳定性均强于Ⅱ型受体，Ⅱ型VLDL受体胞外段水解脱落的更快，但两种亚型受体在受体的摄取、内吞、胞内降解等方面无明显差别。 本实验对VLDLR两种亚型在正常和AS家兔骨骼肌和主动脉平滑肌中的分布进行研究，并进一步探讨造成受体亚型表达变化的原因，以期获得VLDLR亚型表达与分布相关的资料以及对VLDLR的功能与调节的初步研究。 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 试剂 异硫氰酸胍、DEPC、MMLV反转录酶、 Oligo d（T）、Taq聚合酶，均购于Promega公司; 氯仿、异丙醇购于上海试剂公司; 水饱和酚购于北京Bioasia公司; dNTP购于TaKaRa公司;胆固醇购于上海试剂公司。 1.1.2 实验标本 正常家兔组织取材：取正常家兔1只，颈动脉放血法处死，打开胸腔，取骨骼肌约1mg。取下主动脉从左心室到膈肌这一段剪下，PBS冲洗去血液，将动脉剪开，用大头针固定于蜡块上，用手术刀轻轻刮表面破坏内皮，PBS再次漂洗，用手术刀轻轻在动脉内面划“井”形切口，用眼科镊撕下动脉平滑肌层，约1mg。加入变性剂（异硫氰酸胍，十二烷基肌酸钠，柠檬酸钠，β巯基乙醇）700μl，-70℃冷冻保存。 动脉硬化（AS）模型兔的取材：选取3～6月龄的健康家兔，建立动脉硬化（AS）模型兔，所用兔饲料为普通干饲料中添加3%甘油三酯和1%胆固醇，在饲料房自制。饲养3个月后，取兔的骨骼肌、主动脉平滑肌层各约1mg，加入变性剂（异硫氰酸胍，十二烷基肌酸钠，柠檬酸钠，β巯基乙醇）700μl，-70℃冷冻保存。 1.2 方法 1.2.1 总RNA的提取 取1mg组织，加入700μl变性剂，冰浴，匀浆至无明显组织块，置冰中5min，加入NaAc（4mmol/L，pH 4.2）70 μl，震荡混匀，冰浴1min；加入等体积酚/氯仿混合物（4：1），震荡混匀；静置5 min；4℃离心12,000rpm 15min; 弃沉淀，移上清液入一新的EP管，加等体积异戊醇沉淀2hr，离心15,000rpm 30 min，可见微黄色的RNA沉淀，溶于适量去离子水中。取1μl稀释250倍，经紫外分光光度计分析，如果OD260/OD280 1.9,则表明蛋白质杂质较少，可用于反转录。 1.2.2 逆转录反应 每管取总量为1μg的RNA溶液, 加入1μl oligo d(T), 加入去离子水至总体积为15μl，混匀，70℃, 5min，后迅速置于冰中冷却1 min；各管中加入反应混合液11μl (MMLV反转录酶1μl(5u), 5×buffer 5μl, dNTP 2.5μl (4×10mmol/L), 去离子水2.5μl ) ，总体积为26μl。42℃, 1hr；72℃,.freelin，终止反应, 放置- 20℃保存cDNA。 1.2.3 PCR 反应 Olink 糖链结合域两端的引物［9］位于VLDL受体cDNA的2243bp至2556bp处，编码VLDL受体胞外段紧靠胞膜富含苏氨酸/丝氨酸的区域，Ⅰ型受体的扩增片断为355bp，Ⅱ型受体的扩增片断为271bp: P1 5’GCC ACT CTA GTC AAC AAC CT3’ P2 5’GAA GTC CCT TTT GGG GGA AC3’ βactin引物的扩增区域为人类细胞微球蛋白基因的保守区域，所扩增的片段为316bp: P1 5’TGA GAC CTT CAA CAC CCC AG3’ P2 5’GCC ATC TC