鬼臼毒素二元醇质体体外抗宫颈HPV感染探究.docVIP

鬼臼毒素二元醇质体体外抗宫颈HPV感染探究 　　【摘要】 目的 研究鬼臼毒素二元醇?|体（POD-BE）体外抗宫颈人乳头瘤病毒（HPV）感染的效果。方法 采用超声注入法制备POD-BE， 采用透析法测定POD-BE包封率（EE%） ， 观察POD-BE形态学、外观性状及稳定性， 运用CCK-8法和流式细胞术（FCM）分别检测POD-BE和POD处理后永生化人宫颈上皮细胞（H8细胞）的增殖和凋亡， 以透射电镜和激光共聚焦显微镜 （LCSM）分别观察细胞的形态变化及药物在细胞的分布。结果 制备的POD-BE混悬液电镜下为类球状小囊泡， 平均粒径（84.6±9.2）nm， Zeta电位（-27.2±4.2）mV。保存在4℃冰箱内的POD-BE样本， 6个月内仍保持半透明、质地均匀外观， 未见沉淀及药物结晶析出。3000 r/min离心20 min未发现分层现象。而保存在室温下的样本， 24 h未见任何变化， 3～6个月时出现少许混浊， 震荡后样本恢复均一外观， 未见药物结晶析出。POD-BE组和POD组均呈剂量和时间依赖性地抑制H8细胞的增殖。在相同浓度同一时间条件下， POD-BE组对H8细胞的增殖抑制效果明显强于POD组（P 　　【Key words】 Podophyllotoxin； Binary ethosomes； Apoptosis； Cervical human papilloma virus 尖锐湿疣（condyloma acuminatum， CA）是由人乳头瘤病毒（human papilloma virus， HPV）感染引起的性传播疾病， 而高危型HPV是导致女性宫颈癌的主要原因[1]。鬼臼毒素（podophyllotoxin， POD）酊剂是治疗CA最有效的一线药物， 在临床上应用广泛。但其靶向性和黏附性差， 对皮肤及黏膜的刺激性大， 不?m宜用于阴道和宫颈CA的治疗， 且对HPV潜伏感染疗效不佳， 因而其临床应用和疗效发挥受到了限制。随着纳米医药学的发展， “醇质体”（ethosomes， E）作为一种新型的药物载体， 以其良好的组织相容性和靶向缓释特性， 正日益成为局部药物治疗的研究热点[2]。在“醇质体”处方中， 引入丙二醇， 则变成“二元醇质体”（binary ethosomes， BE）。本课题组在既往研究及相关研究的基础上[3， 4]， 利用纳米技术制备了靶向性更强的POD-BE， 以H8细胞（HPV16阳性）为靶细胞， 通过研究其对细胞增殖和凋亡的影响， 为宫颈HPV的临床防治提供实验依据 1 材料与方法 1. 1 POD-BE的制备和包封率（EE%）测定 采用超声注入法制备POD-BE。取处方量鬼臼毒素、卵磷脂、胆固醇用无水乙醇/丙二醇混合溶剂溶解， 在密闭条件下边搅拌边用注射器加入超纯水， 磁力搅拌1000 r/min， 将注射器中的超纯水以180 μl/min的流速注入磷脂混悬液中， 注入完后再搅拌30 min， 温度始终维持在30℃。然后在冰水浴条件下超声处理1 min， 再经过过滤即得POD-BE。POD-BE包封率（EE%） 测定采用透析法测定[4] 1. 2 POD-BE形态学、外观性状及稳定性观察 将稀释至一定浓度的POD-BE滴加在覆盖碳膜的铜网上， 以 3%磷钨酸负染， 使用透射电镜观察其粒径大小和形态， 并照相。然后分别将样品置于4℃及室温下储藏， 在 24 h 及6 个月时检测其粒径及包封率， 并3000 r/min离心20 min， 观察是否分层或出现沉淀 1. 3 H8细胞培养和POD-BE的增殖抑制效应 将H8细胞株（中国医学科学院基础医学研究所提供）在含有10%胎牛血清的DMEM高糖培养基中进行常规传代培养。取浓度为2.5×105/ml的对数生长期的H8细胞接种于96孔板中， 每孔200 μl。实验分为POD-BE组、POD组、空白BE组（加入等体积的空白BE混悬液）、空白对照组（加入等体积的培养液）， 其中POD-BE组、POD组分别设0.1、1、10、100、1000 μg/L浓度组。每孔均设3个复孔。分别培养12、24、48 h后， 加入10 μl浓度为5 mg/ml的CCK-8溶液， 以酶标仪检测各孔OD值（λ=450 nm）。细胞增殖抑制率= [（对照-本底）-（给药-本底）]/ （对照-本底）×100%。Logit 法计算半数抑制浓度 1. 4 Annexin V/PI检测细胞凋亡 调整细胞浓度为1×106/ml， 实验分为POD-BE组、POD组和空白对照组（加入等体积的培养液）， 其中POD-BE组、POD组分别加入含终浓度均为10 μg/L POD和POD-BE培养液， 药物干预24 h后， 收集细胞， 按Annex