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生物化学实验技术与方法 实验讲义 生物化学教研室 （2005年9月） 目录 实验一：糖的薄层分析---------------------------------------2 实验二：高等植物DNA的提取和纯度鉴定------------3 实验三：苯丙氨酸解氨酶的纯化和活性测定-----------5 实验四：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质分子量 ---------------------------------10 实验一 糖的薄层层析 实验目的 学习和掌握薄层层析的原理和方法 实验原理 薄层层析是一种微量而快速的层析方法。该法是把吸附剂或支持剂涂布在玻璃板上成为一薄层，将要分析的样品滴加到薄层上，然后用合适的溶剂进行展开，使样品各个成分分离，然后进行定性鉴定和定量测定。 根据原理的不同薄层层析通常有4种类型：吸附薄层层析，分配薄层层析，离子交换薄层层析和薄层电泳。 本次实验是以硅胶H为吸附剂的薄层层析。硅胶H是粘性差的纯硅胶；其特性是能用腐蚀性显色剂检测。 实验操作 1. 硅胶H薄板的制备：注意胶要均匀。 2. 板的处理： 薄板的活化：活化后冷却的速度不能过快。 薄板的刮分：径向层析的优点是：样品展层后图谱呈弧形带状，使Rf值相近的化合物也能清楚地分开。 3. 点样：样品为鼠李糖、甘露糖、木糖和葡萄糖。点样量20-30μl。注意：点样点的直径小于2mm，点样要少量多次，吹风机风力不能过大。 4. 展层：展层溶剂为：乙酸乙酯：甲醇：乙酸：水=12：3：3：2（体积比），新鲜配制。 5. 显色：显色剂：苯胺-二苯胺-磷酸试剂。 结果与讨论 1. 根据显色结果，计算Rf值，根据颜色、Rf值判断糖的存在。 2. 哪些因素对薄层层析的结果产生影响？ 实验二 高等植物DNA的提取和纯度鉴定 一、实验目的 掌握提取真核细胞DNA的一种基本方法，学习紫外吸收法测定DNA的含量和纯度。 二、实验原理 高浓度的盐和离子表面活性剂SDS能破坏细胞膜，并能解聚脱氧核糖核蛋白复合物（DNP），使DNA释放出来。 苯酚可使蛋白质变性，蛋白质溶于酚相，DNA则溶于上层水相。将氯仿与苯酚混合使用，可减少酚相中因水的存在而造成DNA的少量溶解。95%乙醇可使核酸从水相中沉淀出来，用70%的乙醇洗涤可除去一些盐分，经RNase降解RNA，可得较纯的DNA。 DNA含量与纯度的测定，目前常用紫外吸收法，利用核酸在260nm有吸收峰，根据公式（DNA[ug/ml]=A260×50×稀释倍数）可计算出DNA的浓度。由于蛋白质在280nm有吸收峰，可根据比值判断DNA纯度：A260/A280〈1.8时，表明蛋白质含量偏高；A260/A280〈1.9时，表明样品较纯；A260/A280〉2.0时，表明RNA或DNA碎片较多。 三、仪器、试剂和材料 仪器 普通离心机；冰箱；恒温水浴箱；紫外分光光度计；可调整微量取样器；50ml量筒；2ml烧杯；滴管 试剂 抽提液（2mol/LNaCl-1mmol/LEDTA）；10%SDS；盐饱和苯酚（SS-苯酚）：重蒸苯酚用1mol/Ltris-HCl缓冲液（pH8.0）饱和；氯仿－异戊醇（24：1）；95%乙醇；70%乙醇；TE缓冲液（10mmol/Ltris-HC，1mmol/LEDTA，pH8.0）；RNase 材料 植物材料或丙酮粉 四、操作步骤 DNA的提取 将已制备好的丙酮粉转入50ml离心管。 加15ml抽提液及1.5ml10%SDS，搅拌后放入600C恒温水浴2h。 离心（4000r/min，8min，250C），上清夜转入100 ml离心管中。 分别加入一倍体积的SS-苯酚和氯仿－异戊醇，盖上离心管盖，轻轻倒转混匀。 再离心（4000r/min，8min，250C），用干净滴管取上层水相转入50ml烧杯中。 加入二倍体积预冷的95％乙醇，置冰箱冷冻层0.5-2h。 用玻璃棒将DNA沉淀轻轻捞起，转移至干净的50ml离心管，加入5ml70%乙醇浸泡数分钟，离心后弃去乙醇，管口扣于吸水纸上，吸去残留溶液。 加入4mlTE缓冲液，摇动，使沉淀完全溶解。 加入Rnase液10ul，370C水浴1 h。 重复步骤（4）-（8）。 DNA紫外测定 以TE作空白调零，在波长260nm和280nm处分别测定样液的吸光值。 五、结果处理 计算样品液中DNA含量（ug）。 2、分析样品纯度。 六、注意事项 离心管中加入SS-苯酚和氯仿－异戊醇后，需轻轻倒转混匀，此时注意动作的力度。 七、思考题 为什么实验步骤（1）-（5）没有在冰浴条件下进行？ 实验中数次离心，每次离心后应保留哪部分？弃去的部分主要含什么？ 实验三 苯丙氨酸解氨酶的纯化及活性测定 实验目的 掌握纯