河北农业大学物分离工程 第九章 色谱技术.ppt

Chapter 9色谱技术Chromatography 本章主要内容 一、概述 二、吸附色谱 三、分配色谱 四、离子交换色谱 五、凝胶色谱 六、疏水作用 七、亲和色谱 八、蛋白质分离常用的色谱方法 一、概述 色层法是目前广泛应用的一种分离技术，本世纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色素。 现在色层法已成为生物工程、生物化学、分子生物学及其它学科领域有效的分离分析工具之一。 层析法的发展过程 1903年 Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论文，三年后他在另外两篇论文中正式提出色谱法。 1931年 色谱法提出后，并未立即受到重视。经过大约20年，由于Lederer的工作，人们才重视色谱技术。 1938年 Izmailov和Shraiber第一次使用薄层色谱法。 1938年 Taylor和Uray用离子交换分离锂和钾的同位素。40年代，合成离子交换树脂商品出现后，离子交换色谱才得到广泛应用。1944年在美国橡树岭国家实验室和衣阿华州立大学分离和鉴定了稀土元素。在1944年到50年代中，芝加哥大学和加州大学完成了超铀元素的分离。 1941年 Martin和Synge发展了分配色谱。 1944年 Martin等发展了纸色谱。 1952年 Martin和James发展了气-液分配色谱。 1956年 Van Deemter等发表关于色谱效率的速率理论，并应用到气相色谱中。 1957年 制作离子交换色谱氨基酸分析仪。 1959年 在Cordon Conference上提出了第一篇凝胶过滤色谱的报告。 1963年 Giddings的理论工作为现代液相色谱奠定了理论基础。 60年代中期 凝胶渗透色谱出现。 60年代后期 亲和色谱出现。 1969年 现代液相色谱开始受到重视。 有两次诺贝尔化学奖是授予色谱学领域的研究工作：1948年瑞典科学家Tiselins由于他的关于电泳和吸附分析的研究获奖，1952年英国的Martin和Synge因为发展了分配色谱而获奖。 色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分， 有以下几种： 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 对所有的层析系统来说，必须具备三个单元部分，一个是固定相，一个是移动相，另一个是需要离析的样品。 固相的阻滞作用是由不同的机理产生的,其中包括相的变化、相的分配、在溶液中的分子筛效应或电场作用。 色谱分离的基本概念 分配系数 可由Langmuir方程得出 Kd---分配系数 q、c---溶质在固相和液相中的浓度 阻滞因子Rf 阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0）的迁移率之比 其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力大小 洗脱体积 色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体积，为洗脱体积 不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同，洗脱体积也有所差异 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离度与柱高之间的关系 理论塔板数的计算方法： N---理论塔板数 tR---保留时间 W1/2---半峰宽 Wb---峰底宽度 理论塔板高度：L---柱长 二、吸附色谱 原理:利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力(范德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键)的差异而实现分离 关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动相）的选择 吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团，如-OH和-NH2 常用的吸附剂： 氧化铝 硅胶 活性炭 纤维素 聚酰胺 硅藻土 展开剂的选择 展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力越大 因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性以获得最佳的分离的效果 展开剂选择的原则： （1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力，极性应比被分离物质的极性略小 （2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解能力 一般吸附色谱的操作程序 根据要分离组分的性质（包括极性、分子量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 吸附操作：选择合适的操作条件（温度、pH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测定穿透样品含量以调整操作参数 洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pH值以及体系离子强度，最大限度地回收目标产物 三、分配色谱 原理：利用溶质在固定相和流动相之间的分配系数不同而分离的方法 要素：固定相、载体、流动相 载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 载体种类： 硅胶 硅藻土 纤维素 葡聚糖凝胶 固定相是非极性的，流动相是极性的（反相色谱法） 固定相是极性的，流动相是