人MT1H基因对肺腺癌细胞A549增殖的影响及其机制论文.docVIP

　　人MT1H基因对肺腺癌细胞A549增殖的影响及其机制论文 侯新芳，樊青霞，王留兴，王瑞林，陆士新，赵培荣 【摘要】 目的 研究外源性人金属硫蛋白1H（MT1H）基因稳定转染对肺腺癌细胞A549生长的影响及其机制。方法 构建MT1H基因真核表达质粒pcDNA3.1（）MT1H,以脂质体法转染A549细胞，经G418筛选，获得阳性单克隆细胞。用RTPCR和T1H mRNA和蛋白表达.freelRNA水平明显升高。结论 MT1H能够促进肺腺癌细胞A549增殖，可能和上调cyclinD1促使细胞进入S期增多有关。 【关键词】 肺癌；金属硫蛋白1H；细胞增殖；cyclinD1 Abstract：Objective To investigate the effects of exogenous MT1H gene stably transfection on groa cell A549 in vitro. Methods A rebinant eukaryotic expression plasmid pcDNA3.1（）MT1H ine 2000. Positive monoclone RNA and protein respectively. The cell proliferation ined by MTT assay. The alterations of cell cycle ined by floetry (FCM).Then the expression of cyclinD1 mRNA ined by RTPCR. Results MT1H mRNA and protein ber of G0/Gl phase obviously decreased ber of S phase increased, cyclin D1 mRNA levels elevated. Conclusion MT1H could promote proliferation of lung adenocarcinoma cell A549 by upregulating expression of cyclin D1 to facilitate cells into S phase. Key a; MT1H; Cell proliferation; cyclinD1 0 引言 金属硫蛋白（MTs）是一类富含半胱氨酸，缺少芳香族残基的低分子量蛋白质。人MT基因位于染色体16q13，包括10个功能性基因和7个非功能性基因 1。功能性基因包括：MT2A、MT1A、MT1B、MT1E、MT1F、MT1G、MT1H、MT1X、MT3、MT4。目前很多研究发现MT和肿瘤发生发展有关 2。 ECRG2基因是通过mRNA差异显示技术，利用正常食管血组织和来自林县的三对高癌家族分离与鉴定的新基因 3。Cui Y等 4通过酵母双杂交技术发现ECRG2和MT1H有相互作用。进一步研究MT1H和ECRG2具体如何相互作用，首先需要明确MT1H的功能。本实验我们首先构建携带MT1H基因的重组真核表达载体pcDNA3.1／mychis（）MT1H，然后对转染该基因的肺癌细胞A549的增殖特性进行了实验研究。 1 材料与方法 1.1 细胞株、菌株和载体 肺腺癌细胞A549由本室保存。真核表达载体pcDNA3.1/mychis（）B、DH5a菌株、含pACT2MT1H的DH5a菌株来自中国医学科学院肿瘤研究所病因室。 1.2 主要试剂 TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、XbaI和BamHI内切酶、100bp Ladder marker、DNA胶回收试剂盒、逆转录试剂盒均为Takara产品。LipofectamineTM 2000、TRIZOL均为Invitrogen公司产品。MTT为Sigma公司产品。鼠抗人His抗体、HRP标记的山羊抗鼠IgG抗体购自北京中山生物技术公司。引物由北京奥科生物公司合成。 1.3 目的基因的扩增 据MT1H全长cDNA序列及pcDNA3.1/mychis（）质粒图谱，设计一对引物：P1：5′TGA TCT AGA ATG GAC CCC AAC TGC TCC 3′，在上游引物5′端引入XbaI酶切位点；P2：5′GAT GGA TCC GGC ACA GCA GCT GCA C 3′，在下游引物5′端引入BamHI酶切位点。以质粒pACT2MT1H为模板，扩增MT1HcDNA。PCR条件为：94℃变性30sec，56℃退火35sec，72℃延伸1min，共35个循环。PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定。 1.4 pcDNA3.1()MT1H重