低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的研究论文.docVIP

　　低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的研究论文 马燕 ，陈宝安，吴巍，姜藻，钱梦 ［摘要］ 目的：研究低频低强度超声波诱导白血病细胞株K562凋亡的作用及其机制。方法：取对数生长期的K562细胞，分成实验组和对照组，用MTT法计算细胞存活率，流式细胞仪判断细胞凋亡.freelia cell lines K562 and to clarify the role of Caspase3 in the effect. Methods K562 cells in log phase ental group. The intensity of lo-2 respectively.The exposure time e of periods (6,24,48h) after sonication and the number of vital cells orphology of apoptosis ission electron microscopy. The percentage of apoptosis etry (FCM). The activation of Caspase3 etric method. Results The absorbance value of MTT decreased significantly after exposure. The highest apoptosis embrane blebbing, chromatin condensation, nuclear fragmentation, and apoptotic body formation. FCM revealed that the percentage of apoptosis of cells in control group, in 0.03 I 1640培养液重悬，调细胞浓度为5×105ml-1。分成对照组与实验组，实验组选取不同声强（0.03、0.10、0.25TT法计算细胞存活率 将不同照射组以及对照组的细胞取出，分别计数，培养液稀释至2×105ml-1 ，置于96孔板中，每孔100μl；每组设3个复孔，向每孔加入MTT液10μl（浓度为5μg ml-1），于37℃ 、5%的CO2培养箱中孵育4h，1500r min-1平板离心10min；弃上清后加入二亚甲砜（DMSO）100μl 孔-1，振荡10min，待沉淀完全溶解后于550nm处在酶标仪上测吸光度（A）。按下式计算细胞存活率：细胞存活率（%）= A实验孔/A对照孔×100%。 1．2．4 流式细胞仪检测 收集不同照射组和对照组K562细胞1×106个，冷PBS洗涤2遍后，用50μｌ1×annexin结合缓冲液悬浮细胞，加annexinⅤ FITC5μｌ，室温避光放置10min,再加PI10μｌ,混匀后室温避光放置5min，冷PBS洗涤1遍，加300μｌ1×annexin结合缓冲液重悬细胞后，立即在流式细胞仪(BectonDickinson)上检测，以annexin+/PI-判断为早期凋亡, annexin+／PI+判断为晚期凋亡。 1．2．5 Caspase3的检测 收集细胞，用PBS洗涤细胞2次，2000r min-1离心5min，收集细胞（3～5）×106ml-1，用50μｌ冰冷的Lysis Buffer悬浮细胞，置冰上20min；4℃10000r min-1离心3min，把离心上清转移到新的离心管中，并放置冰上；标准曲线法测定蛋白浓度，吸取50μｌ含50～200μg蛋白的细胞裂解上清；再加50μｌ的2×反应液，再加5μｌCaspase3 底物，并避光孵育4h，用酶标仪或分光光度计在λ=405nm或400nm处测定其吸光值；通过计算OD试验组/ OD对照组值确定凋亡组的Caspase3活化程度。 1．2．6 瑞氏染色 将干燥好的玻片平置染色架上，滴加染液（Ⅰ液）3～5滴，使其迅速盖满玻片，1min后滴加等量的缓冲液（Ⅱ液），轻轻摇动玻片使染液充分混合，20min后用流水冲去染液，待干，置于显微镜下观察。 1．2．7 透射电镜观察 收集不同照射组的细胞，移入10ml玻璃离心管中，加4℃预冷的PBS(0.01mol L-1，pH7.2)至10ml，用吸管轻轻吹打均匀，2000r min-1离心20min,弃上清。离心管倾斜一定角度，沿管壁缓慢加入4℃预冷的2%戊二醛，送电镜室。 1．3 数据处理 采用SPSS12.0统计软件分析。 2 结果 2．1 MTT法检测结果 0.03) 图2 瑞氏染色结果（100×10，箭头指示凋亡细胞）（略） Fig 2 The morphology of apoptosis b