伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征论文.docVIP

　　伴大豆球蛋白亚基色谱分离和制备及结构表征论文 袁德保 杨晓泉 黄科礼 【摘要】 研究了色谱方法对伴大豆球蛋白组成3个亚基的分离纯化工艺条件，并利用圆二色光谱对纯化得到的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。结果显示：利用离子交换色谱（DEAEsepharose fast flomobilized metal affinity column， IMAC）相结合的方法，能将3个亚基组分完全分开，得到了能制备相对大量的3个亚基α′, α和 β的稳定工艺，纯度为95%，回收率达75%。远紫外CD结果显示.freelatographic method and then the secondary and tertiary structures of three constituent subunits inoethyl (DEAE)Sepharose Fast Flon and immobilized metal affinity column (IMAC) succeeded in isolating these subunits pletely, giving high purity (95%) and a total recovery ratio of 75%. The data from farUV CD shoa等［７］利用基因工程的方法，得到了未进行后期糖基化修饰的亚基以及不具有扩展区的亚基（αc和α′c）。Lovati等3利用制备型双向电泳得到了单一的β亚基和α′, α的混合物。Maruyama等8,9从大豆缺失体中分离得到了3种亚基组分。Duranti等10建立了从传统大豆品种中较大规模制备α′的方法。此外，从传统大豆品种中制备3个亚基的方法也有报道11,12。但仍需建立一种能制备高纯度且较大制备量的分离制备方法13,14。而上述提到的几种制备方法在一般实验室难以操作(如制备型双向电泳、大豆缺失体品种)，且制备量小。 本研究建立了能普遍适用的制备(具有一定制备量)高纯度伴大豆球蛋白的制备方法， 并对制得的3个亚基的二级结构和三级结构进行了表征。 2 实验部分 2.1 仪器与试剂 UVP 凝胶成像系统；AKTA蛋白质纯化仪（美国GE公司）；PYCZ30垂直板电泳仪（北京六一仪器厂）；MOS450园二色谱仪(法国BioLogic公司)。 低变性脱脂大豆片（白豆片，山东新嘉华有限公司提供）。白豆片粉碎后，过０．１８ mm孔径筛并储存于4 ℃下密闭容器中。豆粉蛋白质含量为（55.5±0.4）％，氮溶指数84.0％。树脂（DEAEsepharose fast flomobilized metal affinity column）和柱子（4.5 cm×30 cm, 美国GE公司）。试剂为分析纯或更高级别。 2.2 实验方法 2.2.1 伴大豆球蛋白的制备 采用 Nagano法15制备伴大豆球蛋白，电泳鉴定纯度后，透析、冻干后4 ℃保存以备用。 2.2.2 亚基组分的分离纯化 5 g伴大豆球蛋白溶解在60 mL含6 mol/L尿素的TrisHCl缓冲液（简称为标准缓冲液, pH 7.0）中，先用标准缓冲液将离子交换柱平衡。上样后,.freelol/L NaCl），其中第二个峰为纯度很高的α′和α的混合物。将第二个洗脱峰透析、冻干，以便进行进一步的IMAC分离。将α′和α的混合物（5 g）溶于60 mL 0.05 mol/L TrisHCl缓冲液（pH 7.0, 含0.5 mol/L NaCl和6 mol/L尿素）。先将吸附了Ni2+的IMAC柱子用0.05 mol/L TrisHCl缓冲液（pH 7.0,含0.5 mol/L NaCl和6 mol/L尿素）平衡好，然后上样。用上述缓冲液将柱子上未被吸附的部分洗脱下来， 用含有0.1 mol/L咪唑的上述缓冲液可以将α′洗脱下来。将各部分洗脱液收集，透析、冻干以备用。 2.2.3 十二烷基磺酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE) SDSPAGE 电泳按照Laemmli法16进行。 ２．２．４ 远紫外和近紫外圆二色谱分析 采用园二色谱仪器进行CD测定。远紫外圆二色光谱测定样品浓度为0.1 g/L, 近紫外圆二色谱测定样品浓度为1 g/L。样品溶解在5 mmol/L TrisHCl 缓冲液中。扫描次数为2次。二级结构计算软件为CD Pro。 3 结果与讨论 3.1 伴大豆球蛋白制备 通过Nagano方法15制备得到了伴大豆球蛋白。如图1所示，伴大豆球蛋白（图1，泳道2）具有其典型的３条电泳条带，分别对应的是3个亚基α′, α和 β（分子量分别为75,71和51 kDa）。通过光密度扫描技术，计算得到3个亚基条带的光