使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点论文.docVIP

　　使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点论文 史艳侠， 韩文杰， 彭柔君， 张景航， 黄慧强 姜文奇 【摘要】 【目的】 筛选高效的foxp3 RNA干扰的靶点用于阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因 shRNA 序列，化学合成法合成4条shRNA 序列，构建含foxp3 的靶序列的慢病毒载体；构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点；【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒；成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞；在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3％和95.6 ％的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。 【关键词】 foxp3； FLAG蛋白； 慢病毒载体, CD4+CD25+Treg， RNA干扰 Abstract:【Objective】 To screen the high effective RNA intervening targets of foxp3 gene to block the immunosuppression of CD4+CD25+Tregs. 【Method】 Four shRNA sequences ical method. Lentiviral vector that consists target sequences of foxp3 ents al targets of Foxp3 gene for RNAi can be screened by FLAG fusion protein and lentivirus vector. Key AbIg亚类检测试剂盒均购自Sigma公司。RPMI 1640培养基购自Gibco公司。小牛血清购自Gibco公司。羊抗小鼠foxp3mAb购自eBioscience公司。foxp3慢病毒载体由本试验室构建。Foxp3引物由上海吉凯公司合成, Foxp3-Hind Ⅲ/ Foxp3-KpnⅠ的引物序列为：Forersham公司。SDS设备购自BIO-RAD公司。流式细胞仪为美国BECKMAN-COUTER 公司产品。 1.4 CD4+CD25+Treg细胞的分离 颈脱臼法处死小鼠,取脾脏,在200目滤网上磨碎脾脏，红细胞裂解液裂解红细胞，按照小鼠CD4+CD25+Treg细胞磁珠分离试剂盒说明书进行操作，先阴性选择获得CD4+T细胞;加入FITC标记抗小鼠CD25单克隆抗体,再加入磁珠标记抗FITC,阳性选择获得CD25+T细胞,阴性选择获得CD25-T细胞,通过流式细胞仪(BD FACS Calibur)分析获得的CD4+CD25+T细胞纯度。 1.5 Foxp3总RNA抽提和RT-PCR 测定foxp3 mRNA 水平 取1×106细胞,.freelL Trizol,提取总RNA,根据试剂盒说明书进行操作，将总RNA 反转录为cDNA。PCR总反应体系50 μL，循环参数：94 ℃ 30 min预变性，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，最后以72℃ 延伸10 min。 1.6 表达mfoxp3的293T细胞制备 回收mfoxp3 PCR产物后进行Hind Ⅲ＋KpnⅠ酶切，回收酶切片段后可以进入后续克隆构建入真核表达载体中。将pEGFP－C1: HindⅢ＋KpnⅠ酶切，回收4.7 Kb片段，使用连接酶连接mfoxp3酶切产物和pEGFP－C1，形成mfoxp3R-seq+EGFP-C-F 阳性克隆。PCR 片段长度为701 bp。将阳性克隆送上海Invitrogen公司进行3730型测序仪进行测序分析，引物序列如下：foxp3-HindⅢ，CAGATCTCGAGCTCAAGCTTGGATGCCCAACCCTAGGCCAGC；foxp3-KpnⅠ，GATCCCGGGCCCGCG GTACCTCACTTGTCGTCATCGTCTTTGTAGTCAGGGCAGGGATTGGAGCACT；foxp3R-seq，AACCAGG CCACTTGCAGAC；EGFP-C-F，CATGGTCCTGCTG GAGTTCGTG。 用无血清培养基把293T细胞悬液稀释到200～2 000个/mL，在0.1 mL的细胞悬液中加入0.1 mL的4 g/L的台盼兰溶液。轻轻混匀，数分钟后计数细胞。取培养2～3 d生长旺盛的细胞，用培养液将细胞配成2×106～2×107细胞/mL。在6孔培养板中每孔加入2 mL细胞悬液，培养24 h后细胞融合度控制在70%～8