核酸制备.ppt

* * 生物技术 第三章 核酸样品的制备 1 DNA的制备 DNA的物化性质： 核酸溶于水，不溶于有机溶剂，在细胞核内DNA与蛋白质结合 形成脱氧核糖核蛋白(DNP)。 DNA分子是两性电解质，在生理pH值和碱性条件下磷酸中的H解离，使DNA带负电荷。 DNA在pH5-9范围内稳定，过酸的条件下DNA会脱嘌呤，脱嘌呤处易产生断裂，过碱的条件会使DNA解链，DNA提取缓冲液的pH在7.5-8。 DNA分子易受剪切力而断裂。 DNA 分子在高于90℃时变性。 DNA溶液在260nm处有吸收峰 操作流程：提取→纯化→沉淀→分析、保存 设备： 离心机 电泳仪、电泳槽 紫外灯 水浴锅 高压灭菌锅 提取： 碎细胞壁 破碎细胞膜，使核酸释放到提取缓冲液中。常用方法是在液氮中研磨。 低温保存(-70℃)的材料 新鲜材料 粉末 提取缓冲液 DNA提取缓冲液: 缓冲剂： Tris.Cl, Tris是强碱 加浓盐酸调pH至7.5-8.0。 去垢剂 ： SDS、 CTAB 等，破坏细胞膜，解离DNP，变性 蛋白，抑制DNA酶活性 EDTA ： 螯合镁离子， 镁离子是核酸酶的辅酶。 抗氧化剂 ： pvp 、抗坏血酸等、?-巯基乙醇（变性蛋白质 的作用） NaCl： 调节离子强度、 变性蛋白， 对CTAB法与核酸沉淀有关 DNA提取缓冲液通常在65℃预热、提取过程中缓冲液在65℃ 下温育20min至数小时。 经典的纯化方法： 去除蛋白质—— 酚、氯仿抽提 使核蛋白与核酸解聚，使蛋白质变性 去除无机盐——乙醇、异丙醇沉淀 酚/氯仿抽提： 加入等体积 酚/氯仿(1:1), 颠倒离心管使溶液呈乳状，12000g离心， 取上相。重复抽提过程至有机相与水相界面清楚→等体积氯仿抽提→ 沉淀。 酚: 酸性、易氧化， 需用Tris.Cl缓冲液平衡。加 0.1% 8-羟基喹啉 ，–20度保存。 酚溶液无色，加入8-羟基喹啉后呈黄色，如溶液黄色消失或呈粉色，表明有分氧化物存在，不能再用。 酚的pH与DNA和RNA分配有关，pH低时DNA容易进入酚相，抽提DNA的酚溶液的pH值可定在7以上。 在酚溶液中加8-羟基喹啉有以下优点： 减少酚的氧化 提供颜色指示 抑制RNA酶活力 螯合金属离子，抑制DNA酶 沉淀： 去无机小分子，收获DNA 乙醇70%， 阳离存在 下DNA收缩 沉淀 (两倍体积乙醇) 室温、 –20度、 –70度 异丙醇 0.6-1倍体积，不易挥发 贮备液(mol/L) 终浓度(mol/L） 常用无机盐：NaAc 3.0 (pH5.2) 0.3 MgCl2 1.0 0.01 NH4Ac 10.0 2.0-2.5 NaCl 5.0 0.2 准备工作： 压灭提取缓冲液 121℃ 15min 压灭离心管，Tip头等器具 流程： 液氮中研磨 破碎细胞壁、细胞膜 缓冲液中育温( 65-80℃) 破坏细胞膜，变性蛋白 酚、氯仿抽提 去除蛋白质 乙醇、异丙醇沉淀 收获DNA 70%洗沉淀 去除无机盐、异丙醇 晾干