狂犬病实验室检测技术-培训课件.pptVIP

* （四）狂犬病诊断标准（WS281-2008）中的检测方法 1、DFA法——检测狂犬病毒抗原 意义： 阳性结果，表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。 2、ELISA——检测狂犬病毒抗原 意义： 检测到狂犬病毒抗原阳性有诊断意义。 3、细胞培养方法——分离狂犬病毒 意义： 阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。 * 4、RT-PCR——检测狂犬病毒核酸 原理： 狂犬病毒为负链RNA病毒，PCR前需要经过逆转录酶作用，合成一条cDNA链（RT）,再进行PCR。 检测步骤： 1）病毒RNA的提取 2）逆转录合成cDNA 3）PCR扩增 4）电泳 意义： 阳性结果表明有狂犬病毒感染，有确诊意义。 * 5、狂犬病特异性抗体检测 狂犬病特异性抗体： 在自然感染情况下，狂犬病毒→通过带有病毒的动物唾液→进入机体伤口→在入侵部位基本上不增殖（一般也不侵入血流） →故不能形成病毒血症。 在感染后，狂犬病毒或其抗原→不能与机体免疫系统广泛接触→故机体无免疫应答反应（针对狂犬病毒）。 晚期，狂犬病→破坏血脑屏障→ 大量病毒抗原→进入血流→刺激机体→产生大量特异性抗体。 因此，通常在发病早期血清中查不到抗体或抗体滴度很低，只在临床疾病的晚期出现。 * A. 快速荧光灶抑制试验（RFFIT）—— 测定中和抗体 意义： 中和抗体水平等于或高于0.5IU/ml 血清，表示能得到有效的保护 B. ELISA—— 检测狂犬病毒抗体 意义： 1）接种过狂犬病疫苗的患者抗体滴度大于0.5IU/ml ，表明已获得一定的保护。 2）未接种过疫苗的患者的抗体滴度大于1IU/ml ，且近期有4倍增高，可考虑狂犬病。 3）部分狂犬病患者在临死前抗体滴度也可能异常增高。 * （五）美国 CDC 狂犬病实验室操作手册中的检测方法 1、DFA ——检测狂犬病毒抗原 当 以下情况发生时，需要重复（证实性）检测: 1）包涵体颗粒典型，但视野不到 10％，或视野大于 10％，但抗原分布极 度稀疏（如每个视野中只有 1 到 2 个包涵体颗粒）； 2）包涵体颗粒典型，但染色强度较弱且缺乏特征性； 3） 包涵体颗粒不典型，但染色强度好 （如结构大小均匀、形态规则）； 4） 非特异性荧光颗粒掩盖了少量狂犬病毒颗粒的特异性染色； 5） 两种试剂的检测结果或两个技术人员的结果判定不一致。 当进行重复性确证性DFA检测时，通常采用两种以上的检测试剂进行同比实验。 * 2、 RT-PCR——检测核酸 3、细胞培养法——分离病毒：鼠神经瘤细胞（MNA） 目 的： 从未知的脑悬液中分离狂犬病毒， 作为 DFA 检测之外的另一种确证性检测 结果解释： ?分离到狂犬病毒，结果为阳性。 ?传代 2 次后分离不到狂犬病毒，结果为阴性。 注 ：如果检测到稀疏的病毒抗原或结果可疑，有必要进行第三次细胞传代。 * 4、直接快速免疫组化试验（ DRIT ）——检测狂犬病毒核蛋白 （狂犬病诊断的抗生物素蛋白链菌素-生物素过氧化酶染色技术 ） * 5、其它方法 如：狂犬病样本的单克隆抗体分型 目的： 利用7种狂犬病毒单抗对一些阳性狂犬病样本进行抗原分型鉴定。 * 表格 * * * * * 狂犬病实验室检测技术 * 一、实验室操作前的要求及准备 二、实验室检测方法 * 实验室操作前的要求及准备 （一）实验室条件及生物安全操作要求 （二）检测标本的要求 （三）实验前准备 * （一）实验室条件及生物安全操作要求 1、暴露前免疫 工作人员需要暴露前免疫 意外暴露于狂犬病毒时,必需立即报告部门负责人。 2、P2实验室 操作所有潜在狂犬病感染的材料均应在P2 或P3实验室内进行 (实验室固定毒在P2，病人或动物分离的街毒在P3）。 3、P3实验室 对动物标本进行狂犬病毒分离时，必须在P3 以上条件的专业实验室中进行。 没有P3 实验室，严禁从事狂犬病毒分离工作。 * 4、个人防护