19 病毒对先天性心脏病先天感染的探证及电镜观察论文.docVIP

　　19 病毒对先天性心脏病先天感染的探证及电镜观察论文 .freel病毒样颗粒，也无细胞器的损害.结论B19病毒对先天性心脏病的感染系先天性感染所致，病毒基因可能整合于宿主细胞核内. Keyi-croscopy，electron Abstract:AIMTotestiftheparvovirusB19infectionincar-diactissueincongenitalheartdisease（CHD）iscongenital，andtoobservetheultrastructuralfeaturesofcardiactissueofCHD.METHODSByusingELISA，B19-VP2-IgM 42patientsicroscopyforB19-DNAposi-tivecardiactissueofCHD.RESULTS①B19-IgMpositiveratesnorlesionofcellorganbytransmissionelec-tronmicroscope.CONCLUSIONInfectionofparvovirusB 19isconfirmedtobecongenitalandB19-DNAmightbeintegart-edburg公司.试验步骤为:①待检血清1∶100倍稀释（标准抗体液B及阳性对照1∶10倍稀释），取100μL加入重组B19-VP2包被的反应孔中，37℃孵育1h.②用洗涤液3～5次，每次3～5min.③过氧化物酶标记的羊抗人多克隆抗体IgM100μL，37℃孵育30min，④重复步骤②，⑤加TMB底物液100μL，室温放置10min.⑥加终止液100μL，在A450nm处15min内读取结果，结果判定:以标准抗体液（B液）吸光度20.0%标准差为界值，待测孔吸光度大于其上限的为阳性. 1.2.2巢式PCR检测B19-DNAB19病毒DNA质粒来自沙特皇家医院研究中心（KFSHResearchCenter），其他试剂系Promega公司及华美公司产品，引物设计取B19病毒特异衣壳蛋白VP1的基因保守序列，引物由上海生物工程公司合成.引物序列、病毒DNA提取及巢式PCR方法同文献［8］. 1.2.3ISH进行B19-DNA组织定位以B19-DNA的PCR产物1112bp片段为模板，，按地高辛标记试剂盒（德国Boehringermannheim）公司产品说明，B19-DNA经低熔点胶回收纯化，采用随机引物法标记探针，将准备好的组织载片，经脱蜡、脱水、消化、固定、预杂交，杂交显色，中和反应，封片观察. 1.2.4电镜观察将新鲜组织制成1mm×1mm×1mm的组织块，置于30mL L-1戊二醛磷酸缓冲液中，固定1h，梯度乙醇脱水和丙酮浸泡5min，E-pon812包埋，制成超薄切片，在透射电镜下观察. 统计学处理:采用Epinfoversion5.0统计软件包处理. 2结果 2.1血清中B19┐IgM及心肌组织中B19┐DNA结果42例CHD血清中，B19-IgM阳性3例（7%），而22例对照组中B19-IgM阳性1例（5%），两组比较无差异（P 0.05）.42例CHD心肌组织中，B19-DNA阳性8例，阳性率19%，对照组中B19-DNA均阴性，两组比较有显著性差异（P 0.01，Tab1）.且8例心肌标本中B19-DNA对应的血清IgM均阴性，其中B19-DNA阳性中有1例为23天的新生儿. 2.2B19┐DNA的ISH，心肌组织形态及超微结构变化 2.2.1CHD心肌组织的ISH结果对巢式PCR检出心肌中B19-DNA阳性8例标本进行ISH检测，结果发现有5例心肌组织中有B19-DNA的阳性信号，阳性信号主要集中于心肌细胞核内，呈紫蓝色颗粒状或斑块状，较多集中在核膜下.而血管内皮与间质细胞未见阳性信号（Fig1）. 表1两组血清、心肌中B19-IgM，B19-DNA阳性结果比较 略 2.2.2CHD的心肌组织形态及超微结构CHD心脏常规HE染色，光镜下未见心肌细胞肿胀、萎缩，也未见淋巴细胞浸润及病毒包涵体出现等急性炎症改变.对2例（含1例新生儿）ISH强阳性信号心肌标本，作透射电镜观察，未发现心肌细胞有明显的胞膜、细胞器的损害，胞质内及核内未见有23mm大小的病毒样颗粒存在（Fig2，3）. 3讨论 近年来确认遗传易感性和环境致畸原的相互作用是CHD患者主要发病病因，而后者主要是宫内病毒感染，目前除风疹病毒外，其他病原体与先天性心脏病的关系尚无定论.国外资料报道［2-7，9］微小病毒B19的先天感染可导致多种先天异常，但与先天性心脏病关系的研究，目前仅有部分报道［8］，特别是对先天性