HSV1糖蛋白B基因疫苗体内表达的观察论文.docVIP

　　HSV1糖蛋白B基因疫苗体内表达的观察论文 【摘要】 目的 利用单纯疱疹病毒1型(HSV1)糖蛋白B基因疫苗(pgB)免疫小鼠，观察pgB在小鼠体内的表达。方法 利用pgB肌肉接种方法免疫小鼠，通过免疫组化法检测免疫后2、4、6 l;Vero细胞由长春生物制品所程晓庚教授惠赠;DMEM培养基、15%胎牛血清、大肠杆菌DH5α及真核表达质粒pcDNA3(吉林大学第一医院中心研究室提供);重组真核表达质粒pgB由本研究的前期工作制备 〔1〕。健康BALB/c小鼠(购自吉林大学基础医学院动物实验室)，雌性，体重(18±2)g，4～6 l/L小牛血清的DMEM培养基中，单层细胞形成后，接种HSV1 SM44病毒原液5 μl(TCID50 107.5/ml)，病毒维持液含10 ml/L小牛血清的DMEM，37℃培养。待细胞病理改变达到60%左右时，收获病毒，并离心(2 000 r/min，5 min)，用上清检测TCID50和PFΜ后标明，-70℃冻存备用〔2〕。 1.2.2 质粒的大量提取 将转化有pgB及pcDNA3的大肠杆菌分别划板，在37℃恒温箱内过夜。挑取单菌落，置于150 ml LB液体培养基中，140 r/min、37℃过夜。质粒的提取严格按照无内毒素型质粒DNA大量纯化试剂盒(Vitagene)的说明书进行操作。将最终得到的质粒在紫外分光光度仪下测OD260/OD280和OD260。 1.2.3 质粒的内毒素检测 提纯的质粒pgB和pcDNA3定量分析后，分别取出25 μg用无菌PBS稀释到50 μl，再与终浓度3%氢氧化铝胶悬液1∶1(V∶V)混合，直至全部乳化，鲎试剂检测有无凝集反应。 1.2.4 免疫小鼠〔3〕 BALB/c小鼠随机分为4组，每组30只：A组(实验组)注射含pgB的PBS溶液;B组(阳性组)注射紫外线灭活的病毒液(UV HSV);C组(载体对照组)注射含pcDNA3的PBS溶液;D组(空白对照)只注射无菌PBS(pH 7.4)溶液。 选取肌肉接种的方法。将小鼠双侧大腿内侧肌群用750 ml/L酒精消毒，注射无菌PBS稀释的布比卡因(1.5 mg/ml)每侧100 μl。3 d后进行同部位的多点注射免疫接种：每只鼠每次接种100 μg质粒(溶于0.2 ml无菌PBS溶液)，质粒与终浓度3%氢氧化铝胶悬液1∶1(V∶V)混合，直至全部乳化。间隔3 ，放于预先用多聚赖氨酸处理的载玻片上，60℃温箱烤片过夜。切片用于视网膜VEGF免疫组织化学染色(SP法)检测。显微镜下观察并照相。 2 结 果 2.1 质粒大量提取结果 为免疫小鼠而大量提取的质粒pcDNA3及pgB，经紫外分光光度仪测得OD260/OD280分别为1.812 8及1.903 4。经鲎试剂检测无凝集反应。 2.2 pgB在小鼠体内表达的观察 免疫组化结果示：实验组与阳性组结果一致，免疫后第2、4、6周免疫组化结果均可见HSV1 gB蛋白在视网膜、三叉神经节、脑组织中持续表达，大部分细胞核呈棕黄色，免疫组化呈阳性结果(见图1)，说明接种重组质粒pgB后，pgB在小鼠体内能表达HSV1gB蛋白。而载体对照组和空白对照组同阴性结果一致，未见视网膜、三叉神经节、脑组织细胞呈棕黄色改变(见图2)，免疫组化结果为阴性。 3 讨 论 HSV1是双链线性DNA病毒，其感染在全世界非常普遍，不仅可产生原发性感染，而且还能产生潜伏感染和复发性感染。人群中约有90%以上的人曾感染过HSV1，其危害已引起人们的广泛重视。HSV1是引起病毒性角膜炎、病毒性脑膜炎、口唇生殖器黏膜和新生儿感染的主要病原体。近年来由于抗菌素和皮质类固醇的广泛应用和滥用，使HSV1感染具有明显上升的趋势。 经过二十几年的不断发展，HSV1感染的治疗已取得了明显的进步。从非选择性的竞争抑制病毒DNA酶的抗疱疹病毒类药物，到比较有选择性的病毒核苷激酶的抗HSV1药物;再加上干扰素及不同类型的抗病毒药物的联合应用，使HSV1感染的发生控制在较低的水平。但由于抗生素、激素的不合理使用，病毒耐药株的不断出现，机体的免疫功能受到干扰，一些药物全身应用时对肝肾功能、造血系统的影响，以及对HSV1潜伏机制尚不清楚等，使其在临床应用时受到限制，迄今还未达到理想的治疗效果〔5〕。目前针对HSV1的感染尚无特效疗法，核苷酸类似物及其磷酸衍生物是病毒复制的抑制剂，但不能有效地抑制HSV1的复发感染，国内外许多学者认为针对病毒的特异性自动免疫是控制HSV1的最有效途径。因此HSV1疫苗是治疗和预防单纯疱疹病毒感染的重要研究方向〔6〕。 根据感染特点，可将HSV1疫苗分为抗原发性感染的预防性疫苗和抗复发性感染的治疗性疫苗。HSV1疫苗按其特点和作用机制可