NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立论文.docVIP

　　NOX1基因荧光素酶报告基因系统的建立论文 刘珍 刘伟 刘行海 王伯瑶 黄宁 吴琦 【摘要】 目的：对炎症细胞因子TNFα及IFNγ刺激下，人NOX1基因的表达调控进行初步分析。方法：将NOX1基因5′端上游序列连接到无启动子的PGL3BASIC质粒，构建了PGL3BASIC/NOX1报告质粒。PGL3BASIC/NOX1质粒转染A549细胞，用TNFα、IFNγ刺激12h，双荧光素酶报告基因系统检测基因表达情况。结果：克隆的NOX1片段具有较强的启动子活性，在TNFα和IFNγ共同刺激下，转染报告基因的A549细胞萤光素酶活性与对照相比有明显的增高(约4.3倍)。分析显示NOX1基因5′端上游序列片段含有NFκB结合位点，提示细胞因子刺激的荧光素酶表达增强可能与NFκB位点激活相关。结论：NOX1基因表达水平明显受到炎症细胞因子的调控.freelPromega产品。PCR引物由宝生物工程公司合成，限制性内切酶购自MBI公司。DNA Ligation Kit 、PFU酶为TaKaRa 公司产品。质粒DNA 提取试剂盒、胶回收试剂盒及PCR产物纯化试剂盒购自Omega 公司。转染试剂lipofectamine2000购自invitrogen公司。TNFα、IFNγ购自PeproTech公司，其余为国产分析纯。 1.2 方法 1.2.1 引物设计与PCR的扩增 根据GenBank中Nox1基因DNA序列(登录号：DQ314883)，设计扩增Nox1启动子序列，扩增片段长度为2096bp，在两条引物分别加上KpnⅠ和XhoⅠ酶切位点。 上游引物P1：CGGGTACCTGAAGGTTGCAGTGAAGGGAGATC。 下游引物P2：GCCTCGAGGGTTTGGAGCCCTTCTAGGC。 PCR反应程序如下：94℃预变性3min;94℃变性40sec，58℃退火45sec，72℃延伸2min，30个循环;最后72℃延伸10min。反应结束后取5μl PCR产物用0.7%琼脂糖凝胶电泳观察。 1.2.2 报告基因重组质粒的构建 用限制性内切酶KpnⅠ和XhoⅠ分别酶切PCR产物和质粒pGL3basic，用DNA连接酶连接两者，将构建好的重组质粒转入大肠杆菌感受态细胞，涂板培养，提取质粒，DNA测序(大连宝生物公司)。 1.2.3 转染 A549细胞用含10%小牛血清的DMEM培养基培养。转染前一天按照每孔8×104个细胞接种到48孔板，待细胞生长至融合度大于90%，换无血清培养基，用转染试剂进行转染，每孔分别转染2.5μɡ的重组质粒，6小时后换为含小牛血清的DMEM培养基500μL，继续于37℃，5%CO2孵箱培养，用于下一步细胞因子刺激实验。转染质粒为重组的荧光素酶报告基因载体pGL3NOX1及海肾荧光素酶内对照报告载体pRLTK，两者的比例为200：1。 1.2.4 细胞因子刺激A549细胞 细胞转染后的24-48小时内进行刺激实验。用TNFα，IFNγ刺激A549细胞。实验分组为TNFα组，IFNγ组，TNFα+IFNγ组。 TNFα实验用量为25ng·mL-1，IFNγ实验用量为10ng·mL-1。细胞因子用DMEM培养基稀释，加入转染后的A549细胞，刺激12小时，用DualLuciferase Report Assay System试剂盒中的裂解液PLB裂解细胞，收集裂解产物，10000转/分离心10分钟，上请储存于-20℃。荧光素酶报告基因活性测定采用Beckman Coulter DTX880。实验重复3次。用未刺激的转染后的A549细胞做阴性对照。实验数据采用SPSS软件进行分析。 2 结果 2.1 报告基因重组质粒(pGL3NOX1)的构建和鉴定 PCR产物电泳显示扩增出的片段与实验目的片段大小一致，将PCR片段插入质粒pGL3basic，用限制性内切酶KpnⅠ及XhoⅠ双酶切重组质粒，也切下相应大小的片段，最后采用DNA测序证实pGL3NOX1质粒构建成功(图1)。 2.2 细胞因子对pGL3NOX1报告基因表达活性的影响 细胞因子TNFα，IFNγ刺激转染了报告基因的A549细胞，于刺激后12小时裂解细胞，检测荧光素酶活性。结果显示单独采用IFNγ、TNFα，或者联合采用两种细胞因子刺激，与转染pGL3NOX1报告基因而未加细胞因子的对照组(DMEM对照)比较，荧光素酶活性分别增加3.2、2.7及4.3倍。经SPSS软件分析，各实验组与对照组相比，均为P 0.05。结果见表1和图2。表1 TNFα，IFNγ对NOX1基因报告质粒在A549细胞在中表达的影响 3 讨论 在中性粒细胞、单核细胞等吞噬细胞