NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探论文.docVIP

　　NOX4报告基因重组质粒的构建及表达调控初探论文 赵丽君 刘燕翔 刘珍 王伯瑶 黄宁 吴琦 【摘要】 目的：构建NOX4荧光素酶报告基因质粒载体，探讨NOX4基因表达调控机制。方法：以细胞基因组DNA为模板作，采用PCR扩增NOX4基因上游调控序列(533bp)，插入质粒pGL3basic载体，构建重组质粒pGL3NOX4，重组质粒经酶切和测序鉴定。将pGL3NOX4转染A549细胞，通过细胞因子刺激观察报告基因表达水平。结果：酶切及测序证实NOX4报告基因质粒构建成功。转染报告基因的A549细胞以细胞因子刺激，结果显示NOX4表达增强。结论：成功构建了NOX4荧光素酶报告基因质粒载体.freel为Promega产品。质粒提取，PCR产物纯化及凝胶回收试剂盒购自Omega公司。DMEM培养基、转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。新生小牛血清购自兰州民海生物工程有限公司，细胞因子TNFα、IFNγ购自PeproTech公司。Pfu酶，dNTP,限制性内切酶(Xho1，BamHⅠ)，T4DNA连接酶等购自Takara公司。基因组DNA提取试剂盒，DL2000 DNA Marker购自天根生物技术有限公司。 2 方法 2.1 质粒载体的构建 2.1.1 引物合成 通过GenBank检索NOX4基因全序列，参考相关文献，设计扩增出含有NFκB结合位点的NOX4基因上游调控序列。引物设计采用Primer5.0软件，其序列如下： P1：CCTCTCGAGGAGGGTCCCCACTTTTAGTATGAG P2：GGTGGATCCCATCCTACCAGGCAGAGGTGTTTA 引物分别含限制性内切酶Xho1，BamHⅠ酶切位点，扩增片段全长533bp。引物由大连宝生物技术有限公司合成。 2.1.2 PCR 以细胞基因组DNA为模板进行PCR扩增。反应体系为25μL，含10×PCR反应buffer2.5μL; dNTP 2μL;上下游引物各0.5μL;Pfu高保真酶0.2μL;DNA模板0.5μL;其余加水补足。反应条件为94℃变性3min，之后进行30个循环(94℃ 30s，.51℃ 30s，72℃ 4min,，)，72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，将PCR产物做电泳胶回收。pGL3basic载体用Xho1，BamHⅠ双酶切，小牛肠碱性磷酸酶(CIAP)去磷酸化，1%琼脂糖凝胶电泳，胶回收质粒载体。 2.1.3 重组质粒的构建 经酶切纯化后的PCR产物和pGL3basic载体用T4DNA连接酶连接，转化到E.coli DH5α感受态细菌中，涂布于LB培养板，37℃孵育过夜，挑取细菌克隆提质粒，用Xho1，BamHⅠ进行双酶切鉴定，最后经ABI 3730全自动DNA测序仪进行测序(上海英俊生物技术有限公司)。 2.2 细胞转染及报告基因活性检测 2.2.1 细胞转染 用含10%新生小牛血清的DMEM培养基培养A549细胞。将对数生长期的细胞于转染前24小时，按每孔10×104个细胞密度接种于48孔培养板，当细胞达85-95%时，按照Lipofectamine 2000说明书进行重组质粒pGL3basicNOX4和pRLTK载体转染。具体操作为将细胞培养基换为无血清的DMEM( 100μL/孔)，Lipofectamine 2000与质粒DNA(报告基因重组质粒和内对照质粒pRLTK)以一定比例各加入100μL无血清的DMEM中，5min后混合，室温孵育20min，再加入细胞培养孔，37℃，5%CO2的孵箱中培养24-48h。 2.2.2 细胞因子刺激试验 实验分组为TNFα组，IFNγ组，TNFα+IFNγ组，空白对照组。TNFα终浓度为25ng·mL-1，IFNγ终浓度为10ng·mL-1，在细胞因子刺激A549细胞的不同时间点(6h，12h，24h)，裂解细胞检测NOX4报告基因表达水平。实验均设3复孔。 2.2.3 报告基因活性检测 在细胞因子刺激细胞后的不时间点吸去培养基，PBS洗涤细胞。每孔加入60μL的1×PLB细胞裂解液(按DualLuciferase Report Assay System试剂盒说明配备)，孵育30min，收集裂解液，10000转4℃离心10min，上请储存于-20℃备用。取20μL细胞裂解上请，根据DualLuciferase Report Assay System试剂盒说明进行报告基因萤火虫荧光素酶及内对照海肾荧光素酶检测，仪器采用Beckman Coulter DTX880。实验数据采用SPSS软件进行分析，采用T检验。 3 结果 3.1 报告基因重组质粒(pGL3NOX4)的