PEP1SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性论文.docVIP

　　PEP1SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性论文 张友恩，王家宁，唐俊明，郭凌郧，杨建业，黄永章，郑飞，孔霞 【摘要】 目的： 研究PEP1SOD1融合蛋白转导进入大鼠心肌组织的能力.freelutase；SOD1）是细胞中高水平表达的SOD形式，可以专一性清除超氧阴离子（O2-），从而防止氧应激损伤［4］. 由于SOD1系大分子物质，在生物体内无特异受体和通道，也不能依靠内吞作用等人胞方式进入细胞内，生物学作用的发挥受到很大的限制. 本研究通过基因工程手段表达和纯化SOD1和PEP1SOD1融合蛋白，研究PEP1SOD1融合蛋白转导入大鼠心肌组织的能力及其酶活性，为临床应用抗氧化酶SOD1治疗氧应激损伤提供依据. 1材料和方法 1.1材料健康雄性SD大鼠72只，体质量(250±20) g，(湖北省实验动物中心)；pBluescript Ⅱ SKSOD1质粒（美国西奈山医学院生物化学/药理学系白景香博士惠赠）；pGEMT easy vector 系统（美国Promega公司）；pET15b，E.coli BL21（DE3）（美国Novagen公司）；DH5α（郧阳医学院临床医学研究所提供）；PEP1肽DNA序列（北京赛百盛基因技术有限公司）；异丙基硫化βD半乳糖苷（isopropyβDthiogalactoside, IPTG）（美国Promega公司）；兔抗Hisprobe（G18）抗体（美国Santa Cruz Biotechnology公司）；小鼠抗心肌TnT抗体，四乙基若丹明异硫氰酸盐（tetraethyl rhodamine isothiocyanate, TRITC）标记的山羊抗兔二抗、异硫氰酸荧光素（fluoresein isothiocyanate，FITC）标记的山羊抗小鼠二抗（美国KPL公司）；4，6二氨基2苯基吲哚（4,6Diamidino2phenylinole, DAPI）（美国Sigma公司）；SOD检测试剂盒（南京建成生物工程研究所）. 1.2方法 1.2.1SOD1，PEP1SOD1融合蛋白的表达、纯化和鉴定将构建的原核表达质粒pET15bSOD1［5］，pET15bPEP1SOD1［6］分别转化E.coli BL21(DE3)宿主菌，用IPTG诱导分别表达出SOD1和PEP1SOD1 目的蛋白，采用Ni2+金属螯合亲和柱层析对其进行纯化，对纯化后的蛋白取样，进行SDSPAGE电泳，将样品蛋白转移到NC膜上，用抗Histag抗体孵育，采用r约为22×103和26×103处有相应的单一杂交条带（图 1）. Bradford法测得SOD1和PEP1SOD1融合蛋白的产量分别为158.5 g/L和212.1 g/L. 2.2纯化后的蛋白酶活性黄嘌呤氧化酶法测定纯化后的SOD1和PEP1SOD1融合蛋白的SOD1 活性分别为15.87×103U/g和12.23×103U/g. 2.3PEP1SOD1转导进入大鼠心肌组织的荧光显微镜下观察荧光显微镜观察结果显示，PEP1SOD1组0.5 h时即可见细胞质和细胞核呈均一的明亮红色荧光信号，随着时间的延长，转导入细胞内的PEP1SOD1逐步增加，1 h时间点达高峰（图2）. SOD1组显微镜下未观察到红色荧光信号，说明SOD1不能进入细胞内（图 3）. 2.4心肌组织SOD1活性结果显示，心肌组织SOD1活性PEP1SOD1组与SOD1组于各个时间点相比较，差异具有统计学意义（P 0.01）. PEP1SOD1组SOD1活性于大鼠尾静脉注射后0.5 h开始升高，1 h时间点达高峰，2～24 h逐步下降. SOD1组各时间点间比较差异无统计学意义（P 0.05）,说明SOD1不能进入细胞内（表 1）. 3讨论 CPP又称为蛋白转导域（protein tansduction domain，PTD），是近年来发现的一类具有跨膜转导能力,大多小于30个氨基酸残基的小分子肽段，具有强大的运载潜能，能携带多种蛋白质、肽段、寡核苷酸、以及铁颗粒等转导进入细胞内［7］. PEP1具有很多其他CPP无法比拟的优势，如将多种靶蛋白以天然活性形式迅速高效的转导入细胞内，而不需预变性；生理缓冲液中具有高度的稳定性；安全无毒性；不受血清影响等，更适合应用于疾病的蛋白转导治疗［1］. Eum等［8］和Choi等［9］的研究显示，PEP1SOD融合蛋白能以天然活性形式穿透小鼠血脑屏障转导入神经元细胞内. 表1两组大鼠心肌组织不同时间点SOD1活性含量 我们前期的研究结果显示，PEP1SOD1融合蛋白能以天然活性形式迅速高效的转导进入体外培养的