Survivin反义寡核苷酸诱导K562细胞株凋亡的实验研究论文.docVIP

　　Survivin反义寡核苷酸诱导K562细胞株凋亡的实验研究论文 李建厂 徐酉华 贾秀红 【摘要】 目的 探讨Survivin反义寡核苷酸对K562细胞株凋亡的影响。方法 将K562细胞分为四组：反义组、无义组、脂质体组及空白对照组，通过脂质体将Survivin反义寡核苷酸转染入各组K562细胞，用免疫组化法测定转染前后K562细胞Survivin基因及Caspase3的表达差异，用 Tunel及Annexin VFITC测定各组细胞的凋亡率。 结果 Survivin基因在K562细胞高表达，转染反义核苷酸后其表达下降，转染Survivin基因反义核苷酸后Caspase3的表达较其它各组升高，K562细胞生长受抑，细胞凋亡率升高。结论 Survivin反义寡核苷酸能够下调Survivin基因的表达.freelia cells induced by antisense oligonucleotide targeting Survivin.Methods Oligonucleotides of plexes ined by immunohistochemistry(SABC). And detected the apoptotic rate of each group ethods: Tunel assay and Annexin VFITC assay.Results The protein of Survivin is overexpress in K562 cells ,but after treated ine TM）购自美国Invitrogen公司，Survivin山羊抗人多克隆抗体及Caspase3鼠抗人单克隆抗体均由美国Santa Cruz公司提供，Tunel原位凋亡试剂盒由德国Roche公司提供，Annexin VFITC凋亡检测试剂盒由晶美生物工程有限公司提供。 1.2 寡核苷酸 Survivin反义寡核苷酸（5’CCCAGCCTTCCAGCTCCTTG3’）及无义寡核苷酸（5’GCCATGGCTACCTTAGCGTT3’）均由上海生物工程技术服务有限公司合成，两端各5个碱基硫代磷酸化修饰。 1.3 细胞培养 白血病细胞株K562由重庆医科大学附属儿童医院外科研究室保存，DMEM F12细胞培养基及胎牛血清均购自Hyclone 公司。K562细胞置37℃、5％CO2饱和湿度培养箱内培养。 1.4 实验分组 分4组，反义寡核苷酸组（反义组）：反义寡核苷酸＋脂质体＋转染液；无义寡核苷酸组（无义组）：无义寡核苷酸＋脂质体＋转染液；脂质体组：脂质体＋转染液；空白组对照组（空白组）：等体积的转染液。 1.5 转染 取对数生长期的细胞，用不含抗生素及血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，接种细胞悬液至6孔板，细胞数为3×105/孔，反义组及无义组加入寡核苷酸与脂质体稀释后的混合液中，反义寡核苷酸终浓度为0.555 nmol/ml，无义寡核苷酸终浓度为0.544 nmol/ml；脂质体组只加入相同剂量的脂质体；空白组只加入同体积的培养液，置37℃ CO2孵箱中培养6 h，培养之后，在不去除转染培养液的情况下，每孔加胎牛血清，使血清终浓度为10％，放入CO2孵箱中继续培养。 1.6 免疫组化法测定转染前后Survivin基因及Caspase3的表达 分别将转染后的4组细胞吹打离心，制成单细胞悬液，均匀涂在玻片中心，室温下凉干。冷丙酮室温下固定15 min，3%H2O2溶液中室温下浸泡30 min，以充分灭活内源性过氧化物酶； 滴加封闭血清，置室温下20 min，甩去多余液体； 滴加相应一抗20 μl，4℃过夜；加生物素化二抗20 μl，37℃ 20 min，滴加SABC试剂，37℃ 20 min，PBS冲洗， DAB显色，显微镜下观察。同时PBS代替一抗做阴性对照。 阳性结果判断（采用染色强度及阳性细胞数进行评分）：染色强度分四级：阴性(0分)、淡黄色(1分)、黄色(2分)、棕黄色(3分)；阳性细胞数分五级：＜5%(0分)、6%～25%(1分)、26%～50%(2分)、50%～75%(3分)、＞75%(4分)；随机计数5个视野，每个视野计数200个细胞，计算阳性细胞率。两者的乘积作为最终的结果判断：0分（－）、1～4分（+）、5～8分（++）、9～12分（+++），评分越高说明阳性程度越高。 1.7 Tunel法检测细胞凋亡率［4］ 将4组细胞制备单细胞悬液，涂片，4%的多聚甲醛（用0.01 M PBS配制）在15～25℃条件下固定60 min，用含3%H2O2的甲醇溶液孵育10 min，在冰上（2～8℃）用透化液（含0.1% Triton X100 的0.1%枸橼酸