β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定论文.docVIP

　　β半乳糖苷结合凝集素9真核表达载体的构建和鉴定论文 邱文洪 吴丽娜叶 许楚娟 易路阳 郭凯文 【摘要】 目的： 构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体并鉴定。方法：通过DNA重组技术和PCR方法从人外周血单个核细胞克隆β半乳糖苷结合凝集素9基因，插入真核表达载体pcDNA3.1(+)中，通过PCR、酶切及测序鉴定重组载体的正确性。结果：DNA测序和酶切鉴定证明β半乳糖苷结合凝集素9基因正确克隆至pcDNA3.1(+)的多克隆位点。结论：成功构建β半乳糖苷结合凝集素9的真核表达载体pGal9。 【关键词】 Gal9; 构建; 真核表达载体 半乳糖凝集素家族(galectin family)成员参与了许多生理和病理过程，包括细胞间黏附、细胞生长调节、RNA转录后加工、炎症反应、免疫调节、肿瘤的转化以及细胞的凋亡等1，2。β半乳糖苷结合凝集素9(Gal9)是一种糖结合蛋白，属于半乳糖凝集素家族(galectin family)成员，组织分布广泛，在介导细胞分化、凋亡、黏附、细胞间聚集、炎症反应的调控和肿瘤转移等方面.freelega)，RNA提取试剂盒(Invitrogen)，质粒提取试剂盒、DNA凝胶纯化试剂盒(Qiagen)，DNA marker(Tiangen)，Trizol、1640培养基，人淋巴细胞分离液(天津灏洋生物制品科技有限责任公司)，胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)，Galectin9引物(英骏生物技术有限公司)。 1.2 引物设计 参照GenBank上Gal9(NM009587.2)序列设计引物如下:上游引物:P1 5CCAAGCTTGGGTTAAGTCGTTCCCTCTACAA 3，下游引物:P2 5CGGAATTCCGAGGACCCAGACTGCCCCAC 3，下划线分别为HindⅢ和EcoRⅠ酶切位点,扩增Gal9的CDS序列,共1176 bp。 1.3 分离人外周血单个核细胞 静脉取血，加入肝素溶液(10～50u/m1血样本)抗凝，用pH7.2 Hanks液将抗凝血稀释1倍;吸取人淋巴细胞分离液置于刻度离心管中，加入稀释的全血; 2000 r/min离心20min;吸取所有单个核细胞，用Hanks液洗涤细胞3次。将单个核细胞离心收集备用。 1.4 单个核细胞总RNA的制备、RTPCR及克隆入载体pcDNA3.1(+) 将离心收集的单个核细胞1×105加入Trizol 1 mL，混匀，室温5 min;加0.2 mL氯仿，涡旋15 s， 4℃12 000g，离心10 min，吸取上清液至另一1.5 mL Eppendorf管，加入等体积预冷的异丙醇，放置10 min，4℃12 000g，离心10 min，去上清液，加入1 mL预冷的浓度为750 mL/L乙醇，充分混匀振荡，4℃12 000g，离心10min，去上清液，充分干燥，用50μL含1 mL/L DEPC的ddH2O溶解沉淀，获得细胞总RNA。取5μL总RNA，按RTPCR试剂盒推荐方法以oligo(dT)为引物合成cDNA第一链。取2μl逆转录产物为模板,加入10 mM dNTP 1. 5 ml,10′PCR缓冲液5m,l 50mMMgSO41m,l两引物各10pmo,l补水至50m,l PCR反应条件为: 95℃预变性5 min，94℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸1 min，反应30个循环后，72℃延伸10 min。取PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分析。按照arker 1.0～1.5 kb的特异条带，与预计长度1176 bp相符(图1)。 2.2 真核质粒pGal9构建和鉴定 将RTPCR扩增产物，经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后，克隆入真核表达质粒pcDNA3.1(+)。阳性克隆送英骏公司测序，同时进一步对阳性重组质粒进行PCR和双酶切鉴定。以阳性重组质粒为模板，用前述特异性引物进行PCR，可扩增出与预计长度1176 bp相符的目的片段，而空载体则为阴性结果(图2A)。阳性重组质粒经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切后电泳，同样可见与预计长度相符的片段(图2B)。测序结果表明，PCR扩增获得并克隆的Gal9片段序列与GenBank中的序列完全一致(结果未附)。1 Marker;2 RTPCR product of Gal9 gene图1 RTPCR扩增Gal9基因CDS序列A PCR analysis：1 Marker;2 PCR product of pGal9;3 PCR product of pcDNA3.1(+);B Double restriction enzyme digestion analysis：1 Marker;2 p