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　　VEGF, b论文 【关键词】 胎血；内皮祖细胞；诱导 VEGF and bFGF induced differentiation of mononuclear cells from human umbilical cord blood into endothelial progenitor cells in vitro 【Abstract】 AIM: To research a ononuclear cells from human umbilical cord blood in vitro to be differentiated into endothelial progenitor cells under the induction of VEGF and bFGF. METHODS: The mononuclear cells human umbilical cord blood by Ficoll densitygradient centrifugation. The cells edium 199(M199) supplemented munohistochemistry and immunofluorescence. RESULTS: The mononuclear cells from human peripheral blood human umbilical cord blood can be induced to differentiate into endothelial progenitor cells in vitro under certain condition. 【Keya公司. 胎牛血清（杭州四季青公司）. 鼠抗人CD34单克隆抗体，兔抗人KDR单克隆抗体，FITC标记羊抗鼠、羊抗兔二抗，鼠抗人CD133单克隆抗体(Santa Cruz公司). M199培养液，免疫组化染色试剂盒（即用型SABC）（武汉博士德生物工程公司）. 美国Santa Cruz Bio公司荧光显微镜；OlympusCK40型倒置显微镜；低温高速离心机Biofuge22R型. 1.2方法 1.2.1EPCs的采集和分离人脐带血均取自足月健康的产妇，每份采血约40~60 mL，复方枸橼酸钠注射液（ACDA）按1∶10加入抗凝. 然后1∶1加入PBS稀释，EPCs的分离采用Ficoll密度梯度离心法. 2000 r/min, 20 min离心后管内分为三层，取上、中层界面处以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带置入另一离心管中，以Hanks液离心洗涤细胞两次. 末次离心后，弃上清，以Ｍ199培养液（含有100 mL/L胎牛血清，细胞生长因子VEGF和bFGF）重悬细胞. 取一滴细胞悬液与一滴2 g/L台酚兰染色液混合，计算单个核细胞的浓度及细胞活力的检测. 1.2.2EPCs的培养单个核细胞以5×108/L的密度接种于铺有10 g/L明胶的培养瓶中，放入37℃, 50 mL/L CO2，湿度100%的细胞培养箱培养，48 h后弃去贴壁细胞，悬浮细胞离心后用M199培养液重悬，以2×108/L 的密度接种于放有盖玻片的六孔板中. 每3 d换液，用Hanks液洗掉未贴附的细胞. 在培养的第7日收集爬片细胞,进行鉴定. 1.2.3免疫荧光检测取培养第7日的爬片细胞，40 g/L多聚甲醛固定20 min，再用PBS洗3次，每次5 min，干燥后加入FITC直标鼠抗人CD133单克隆抗体100 μL (1∶50倍稀释)，放入湿盒内３７℃保温1 h，同时以PBS替代CD133单抗作阴性对照. 然后用PBS洗２次，蒸馏水洗一次，封片，荧光显微镜下观察. 1.2.4免疫组织化学检测爬片细胞在培养第7天用40 g/L多聚甲醛固定20 min,内源性过氧化物酶用30 ml/L H2O2灭活,非特异性结合用30 ml/L BSA阻断,抗体为兔抗人KDR、鼠抗人CD34. 4℃过夜, SABC法显色,苏木素复染,脱水、封片，倒置显微镜下观察结果. 2结果 从新鲜脐血中得到的单个核细胞呈圆形，苔盼蓝染色显示细胞存活率为99%. 被分离的脐血单个核细胞在培养48 h后出现贴壁，在4～5 d时生长最快，大约在培养5 d出现大量的梭形细胞. 单个核细胞培养5 d后，镜下可见大量的细胞团形成. 大约在培养6 d，可见长梭形细胞以细胞团为中心呈放射状生长. 同时，也可见散在的长梭形细胞. 培养7 d，可见由多个长梭形细胞首尾相连形成条带样排列，有时还可见到两排细胞平行排列呈管样结构（图1）. 进行KDR, CD133和CD 34等表面标记物的免疫荧光及免疫组化检测，免疫组化显示CD34, KDR呈阳性染色. 免疫荧光显示细胞