自拟逆纤方治疗实验性肝纤维化的作用及机制研究.pdf

药，丹参注射液作为阳性对照药物倍比稀释7个浓度上药，用MTT法检测药物细胞 毒性，计算细胞TC50，评价逆纤方对HSC增殖的抑制作用。 Fas／FasLmRNA表达的影响 2、逆纤方对肝纤维化大鼠及体外培养的HSC 本实验部分拟在实验一的基础上，从HSC细胞凋亡着手，进一步探讨逆纤方抗肝 纤维化的机制。采用Anncxin、佃I双染结合流式细胞仪检测HSC凋亡情况。同时运 mRNA的表达进行相对定量。 3、逆纤方对HSC-T6细胞uPA、PAI-1、TIMP．1及MMP-13mRNA表达的影响 实验三从uPA纤溶系统出发，用免疫组化法检测肝纤维化大鼠肝组织中uPA和 PAl．1蛋白的表达并观察逆纤方的调控作用；同时运用实时荧光定量PCR方法，对体 外培养的HSC-T6细胞uPA、PAI-1、lIMP．1及MMP-13mRNA表达进行相对定量， 初步探讨uPA纤溶途径与肝纤维化的关系及逆纤方的调节作用。 三实验结果 ： 1、逆纤方抗肝纤维化的体内外实验研究 对DMN诱导的大鼠肝纤维化模型，逆纤方水提大、小剂量组均可降低大鼠血清 项血清学指标，但效果不及逆纤方水提大、小剂量组。 病理结果HE染色显示，正常对照组大鼠肝脏结构完整，模型对照组可见肝小升 失去正常结构，胶原纤维沿界板破坏处向肝小叶内延伸，多数形成假小叶，所有切片 均可见程度不等、范围不一的肝组织坏死区、多发出血灶，中央或局部有炎性细胞浸 润；逆纤方水提大剂量组肝小叶结构破坏不明显，有2个标本大量纤维沉积于汇管区， 其中1个形成假小叶，其余可见纤维条索，大部分肝细胞排列整齐，所有标本均有少 量炎细胞浸润；逆纤方水提小剂量组标本也可见汇管区纤维沉积，有炎细胞浸润，肝 细胞排列紊乱；逆纤方醇提大剂量组所有标本可见汇管区大量纤维沉积，肝细胞排列 不整齐，炎细胞浸润，3个标本有出血灶；逆纤方醇提小剂量组也可见汇管区纤维沉 积，有炎细胞浸润，肝细胞排列紊乱。 体外实验显示，在药物作用24h后，逆纤方对HSC．T6的半数毒性浓度TC卯为 物作用24h后，逆纤方及丹参注射液对HSC-T6均表现出较强的的抑制作用，且随着 药物浓度的增加，抑制作用有所增强，说明逆纤方及丹参注射液对HSC-T6的抑制作 用有一定的量效依赖关系。结果提示，逆纤方抗肝纤维化的作用与其抑制HSC的增 殖有关。 2、逆纤方对肝纤维化大鼠及体外培养的HSC-T6Fas／FasLmRNA表达的影响 2 流式细胞细胞凋亡的检测结果显示，细胞对照组凋亡率为0．8％，逆纤方30mg／ml 亡率为7．6％，1：40浓度组凋亡率为2．8％。 实时荧光定量PCR结果分析显示，与模型对照组相比，逆纤方水提大剂量组大 ／FasL基因mRNA的表达，但上调水平不及大剂量组：逆纤方醇提大、小剂量组Fas ／FasL基因mRNA的表达量与模型对照组相比无统计学意义。 体外实验，与细胞对照组比较，丹参注射液各浓度组及逆纤方高、低剂量组均可 因的表达调节优于其它各组。 ． 3、逆纤方对ItSC-T6细胞uPA、PAI．1、TIMP-I及MMP-13m砌临表达的影响 体内免疫组化结果显示，逆纤方水提大剂量组，un壤达较其他各组明显增多， 则每个样本均有表达；鳖甲软肝片组uPA有阳性表达，但低于水提小剂量组，PAI-1 则每个样本均有表达。醇提大剂量组则以PAl-1表达最为明显，醇提小剂量组UPA表达 高于醇提大剂量组。 实时荧光定量PCR结果提示，与细胞对照组比较，丹参各浓度组及逆纤方 mRNA的表达 且表现出一定的剂量依赖性。 四结论 l、逆纤方能够降低DMN致实验性肝纤维化大鼠血清肝纤维化指标及肝组织HyP 含量，组织病理学显示其能够，减轻肝脏功能损伤，逆转肝脏纤维化进程。对体外培 养的HSC．I6细胞增殖有明显的抑制作用，且表现出一定的量效依赖关系； 15mg／ml剂量组； 3、逆纤方可通过调节uPA纤溶途径，间接调节MMP8的活性，促进ECM降解， 逆转肝纤维化。 关键词：逆纤方；肝纤维化；机制