香蕉果实转录因子MaWRKY1基因的原核表达和多克隆抗体制备.pdfVIP

园 艺 学 报 2010 ，37 （12）：1929 –1936 Acta Horticulturae Sinica 香蕉果实转录因子 MaWRKY1 基因的原核表达 和多克隆抗体制备 洪克前，邝健飞，陆旺金，陈建业* （华南农业大学园艺学院，广东省果蔬保鲜重点实验室，广州 510642 ） 摘 要：MaWRKY1 是从香蕉果实中克隆出的一个转录因子基因。为进一步研究该基因的功能，制备 了 MaWRKY1 多克隆抗体。选取 MaWRKY1 基因全长中 N 端第 168 ~ 400 个氨基酸之间的包括两个 WRKYGQK 保守域的 cDNA 序列，构建了原核表达载体 pET-MaWRKY1 ，并转化到大肠杆菌 BL21 中诱 导表达菌体蛋白。SDS电泳检测结果表明，His-MaWRKY1 融合蛋白成功获得了高效表达，分子量 在 26 kD 左右。His-MaWRKY1 融合蛋白经过 Ni-NTA 琼脂糖凝胶树脂纯化，SDS制备胶割胶富集， 电洗脱法纯化后得到的纯化蛋白浓度达到0.5 mg · mL-1 。经对新西兰兔进行5 次免疫，获得了多克隆抗血 清，采用免疫吸附方法对抗血清进行了纯化。将纯化后的抗体通过间接酶联免疫（ELISA ）和蛋白质印迹 （Western blot ）分析，表明所制备的抗体具有很好的效价，效价比为 1 ︰160 000，同时具有良好的灵敏度 和特异性。进一步提取香蕉不同组织总蛋白，Western blot 检测显示，在分子量 26 kD 左右处出现特异的 蛋白质条带，证明所制备的抗体可以与香蕉 WRKY 蛋白特异性结合，并且低温可以诱导香蕉果实中 MaWRKY1 蛋白表达，暗示 MaWRKY1 蛋白表达可能与果实耐冷性有一定的关系。 关键词：香蕉；WRKY ；转录因子；原核表达；多克隆抗体；耐冷性 中图分类号：S 668.1 文献标识码：A 文章编号：0513-353X （2010 ）12-1929-08 Prokaryotic Expression of Banana Transcription Factor MaWRKY1 Gene and Preparation of Its Polyclonal Antibody * HONG Ke-qian ，KUANG Jian-fei ，LU Wang-jin ，and CHEN Jian-ye （Guangdong Key Laboratory for Postharvest Science，College of Horticulture，South China Agricultural University ， Guangzhou 510642，China） Abstract ：To investigate the function of the MaWRKY1 gene ，a transcription factor previously cloned from banana fruit，the polyclonal antibody of MaWRKY1 was prepared. The recombinant plasmid pET-MaWRKY1 was constructed with 699 bp segments started from the 168 amino acid to the 400 amino acid including the two conserved motif WRKYGQK and an about 26 kD expressed His-MaWRKY1 fusion protein was identified by SDSfollowing the expression of the recombinant His-MaWRKY1 fusion protein in E.coli BL21 （DE3 ）cells with high efficiency. About 0.5 mg · mL-1 fusi