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5-基因工程及其在食品中的应用-修改版

Fall, 2001 Biotech 黃金米 转基因植物与农作物的抗性 耐储转基因农作物 转基因植物 基因工程疫苗 λ噬菌体基因组的结构 在λ噬菌体线性双链 DNA分子的两端,各有一条由12个核苷酸组成的彼此完全互补的5′单链突出序列,即通常所说的粘性末端。注入到感染寄主细胞内的λ噬菌体的线性DNA分子,会迅速地通过粘性末端之间的互补作用,形成环形双链DNA分子。随后在DNA连接酶的作用下,将相邻的5′-P和3′-OH基团封闭起来,并进一步超螺旋化。这种由粘性末端结合形成的双链区段称为cos位点(略语cos,系英语cohesive-end site的缩写,即粘性末端位点之意)。 在环化的状态下,λ噬菌体DNA分子的长度为48 502碱基对。 左侧区包括使噬菌体DNA成为一个成熟的、有外壳的病毒颗粒所需的全部基因,全长约20kb 右侧区内包含所有的调控因子、与DNA复制及裂解宿主菌有关的基因,这个区域约长12kb。 中间区域约长18kb,这一段DNA可以被外源置换而不会影响噬菌体λ裂解生长的能力。置换型噬菌体λ是使用最广泛的载体。 λ噬菌体载体的构建 构建λ噬菌体载体的基本原理   构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除。  野生型噬菌体λDNA全长约50kb,上有65种限制酶酶切点,除ApaⅠ、NaeⅠ、NarⅠ、NheⅠ、Sna BⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ等7种限制酶各有一个切点外,其余都多于2个。有些酶切点在λ增殖所必需的基因区域内。因此,噬菌体λ必须经过改造才能用作载体。现在用的λ载体大都除去了某种限制酶的酶切点。因此,作为载体的噬菌体λ都短于野生型。    按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体,可以归纳成两种不同的类型:   一种是插入型载体(insertion vectors),只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。   另一种是替换型载体(rePlacement vectors),具有成对的克隆位点,在这两个位点之间的λ DNA区段可以被外源插入的 DNA片段所取代 在基因克隆中的二者的用途不尽相同。插入型载体只能承受较小分子量(一般在10kb以内)的外源DNA片段的插入,广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。而替换型载体则可承受较大分子量的外源DNA片段的插入,所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。 λ噬菌体的体外包装 λ噬菌体DNA的包装限制问题 λ噬菌体头部外壳蛋白质容纳DNA的能力是有一定限度的。上限不得超过其正常野生型DNA总量的5%左右,而低限又不得少于正常野生型DNA总量的75%。 按野生型λDNA分子长度为 48kb计算,λ噬菌体的包装上限是 51kb。编码必要基因的DNA区段占28kb,因此λ载体克隆外源DNA的理论极限值应是23kb。 能容纳大片段(45kb)的小分子(4kb~ 6kb)载体。 组成:质粒复制原点,抗药基因,多克隆位点,已连接入的λcos位点。 Cosmid载体特点 具有λ噬菌体的特点 具有质粒载体的特性 高容量的克隆能力 31-45kb 具有与同源序列的质粒进行重组的能力  单链噬菌体载体 M13    最常用的单链噬菌体载体是M13和它的改建噬菌体。M13是丝状噬菌体,有长约6500个核苷酸的闭环DNA基因组。M13附着在大肠杆菌的F性菌毛上,所以它们只能感染雄性细菌,即F’或Hfr细菌。当噬菌体进入细菌细胞后,单链的噬菌体DNA转变成双链复制型(RF)。从细胞中分离的RF可用作克隆双链DNA的载体。当每个细菌细胞里积聚了200到300份RF型拷贝时,M13开始不对称的合成,即只大量合成DNA双链中的一条链。单链DNA掺入成熟的噬菌体颗粒,颗粒不断地从感染细胞上芽生。M13感染虽不杀死细胞,但细胞的生长受到一定的抑制,所以形成混浊的噬菌斑。   单链噬菌体载体的优点 ①M13的感染与释放不会杀死宿主菌,仅导致宿主菌生长缓慢; ②M13 DNA在宿主菌内既可以是单链也可以是双链; ③M13的包装不受DNA大小的限制,其噬菌体颗粒的大小可随DNA的大小而改变,即使DNA的大小比本身DNA的大小超出6倍,仍能进行包装。由于M13的这些特性,而使之广泛地用于DNA重组。  M13的基因组中除有一段507个核苷酸,其余都含有与其复制有关的遗传信息。因此,只有在这一段中可插入外源DNA而不致影响噬菌体的活性。插入M13的外源DNA超1000bp时就不稳定,在噬菌体增殖时会出现缺失。一般说,插入300~400bp是相当稳定的。 噬菌粒载体 噬粒(phagemid或phasmid)是由质粒载体和单链噬菌体载体构建成的。它们既有质粒的复制起点,又有噬菌体的复制起点。因此,在大肠杆菌细胞里,可以按正常

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