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固定化脂肪酶催化异养小球藻油脂合成生物柴油 李秀峰’，王钮z，徐瀚1，谭天伟z，吴庆余1.‘* (1.清华大学生物科学与技术系，北京 100084; 。2.北京化工大学生物化工系，北京 100029) 摘要:本文讨论了异养小球藻的发酵培养和利用固定化脂肪酶合成小球藻生物柴油的技术路线。在 5L发酵罐中，异养小球藻经过底物补料过程和pH,DO控制过程细胞密度成倍增加.以正己烷为溶 剂高效提取藻细胞内的油脂。固定化脂肪酶 (Candidiasp.99-125)催化小球藻油脂的甲酷化反应， 当温度为38C,醇油摩尔比为3:1，甲醇分三次流加，酶用量为75% (相对于小球藻油脂量)，3 倍于油脂量的正己烷作溶剂，含水量10%，反应12小时，转化率达到98%以上。经测定的小球藻生 物柴油的性质与石化柴油相似，符合ASTM标准，具备成为柴油替代燃料的潜能。 关键词:异养小球藻;原始小球藻 (Chlorellaprotothecoids);发酵过程优化;固定化脂肪酶;生物 柴油 1引 言 生物柴油即采用植物油或动物脂肪与甲醇或乙醇在酸、碱性催化剂或酶的作用下，脂交换生成 的脂肪酸甲酷或乙酷.生物柴油作为石化柴油的潜在替代能源，因其独特的优越性和现实的需求越 来越受到关注.生物柴油可再生、无毒性、可生物降解;十六烷值和氧含量高，燃烧更充分，减少 了一氧化碳、碳氢化合物和颗粒物等污染物排放;基本不含硫和芳烃化合物，二氧化硫和致癌物质 PAH的排放极低:可通过生物技术的应用和农业大规模培养实现可持续发展，保证人类发展的能源 需求川。 制取生物柴油的方法分为化学合成法和生物酶催化合成法[[21。化学合成法是将原料油脂与过量的甲 醇或乙醇等低碳醇在酸或碱性催化剂和高温的作用下转脂化，生成脂肪酸甲脂或脂肪酸乙酷，再经 洗涤干燥即得生物柴油。化学合成生物柴油工艺复杂，酉旨化产物分离回收难，需要相应的醇回收装 置，耗能和成本高，反应过程有废酸或废碱液排放。生物酶法合成生物柴油，即用动植物油脂和低 碳醇在脂肪酶的催化下进行转脂化反应，制备相应的脂肪酸甲酷及乙醋，酶法合成生物柴油具有条 件温和、转化效率高、无污染物排放等优点P1.酶法合成生物柴油的关键步骤是酶的固定化，它使 酶回收和重复使用，降低了生产成本[41e 制约实现生物柴油产业化的关键问题是生物质原料问题，目前国内外选择的主要原料包括从 木本植物的果实或种子中获取原料油、从油料作物中获取原料油以及餐饮废油。本实验室以异养 小球藻为原料，发酵生产异养小球藻油脂制备生物柴油的技术路线己经在2004年报导[510 原始小球藻 (Chlorellaprotothecoids)不但可以进行光合自养生长，还能在高浓度有机碳源、 低浓度有机氮的有机培养基中按异养代谢途径生长，表现为细胞黄化，叶绿素消失，油脂化合物 含量大大增加，细胞的生长和繁殖速率更快[[61。自养藻细胞内脂类化合物含量仅为细胞干重的14.57 %，而异养藻细胞内脂类化合物含量增加了4倍左右，达细胞干重的55.20 。用正己烷抽提法高效 提取藻细胞内的油脂，并在浓硫酸的催化下进行酷交换反应合成脂肪酸甲酷，即生物柴油。在温度 为30C,醇油摩尔比为56:1以及100%原料油重量的浓硫酸催化条件下，反应4小时转化率最高达 到63%[51a 本文旨在对小球藻在发酵罐中的高密度培养进行探索，并利用固定化脂肪酶催化小球藻油脂的 转脂化反应，提高反应的转化率，完善技术路线。 基金项目:国家自然科学重点项科技部项讯联系人:吴庆余。Email: 222 2材料和方法 2.1实验材料 藻种为原始小球藻 (ChlorellaProtothecoids)，由美国得克萨斯大学藻种中心提供。培养基的配 方参照GrantHommersandl1e 固定化脂肪酶 (Candidiasp.99-125)由北京化工大学生物过程加工实验室提供. 2.2异养小球藻的发酵培养及过程优化 在1L三角瓶中，异养小球藻在281C，通气量为1:1wm,弱光 (511molrnZs1左右)条件下培 养。 在51,通风搅拌发酵罐培养实验中，搅拌速度200-350rpm，培养温度28C(11)，通气量1:1wm, 观察批次培养的规律，进而建立补加葡萄糖、调节pH值、控制溶氧浓度