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碱变性法抽提细菌质粒DNA 及其电泳检测 参见《微生物学实验》第174-176页 （赵斌、何绍江 主编 科学出版社） 碱变性法抽提质粒的原理 在pH7.0-9.0之间，染色体DNA结构通常是比较稳定的。当pH高达12.6时（加Sol II），染色体氢键断裂，双螺旋结构松开。质粒DNA大部分氢键也断裂，但仍保持超螺旋的闭合环状结构不变。 用pH4.8醋酸缓冲液（Sol III）调至中性时，质粒DNA很快复性，悬浮在液相中。而染色体DNA不能复性，变成长短不一的片段，与细胞中的大分子RNA、蛋白质、SDS等化合物形成复合物在高速离心力的作用下被沉淀下来，从而达到分开的作用，最后用无水乙醇在-20℃条件下，使质粒沉淀。 实验试剂 提质粒操作步骤 1、将E.coli DH5α（ pUC19 ）挑一环接种于含Ap（ 50μg/ml ）的LB 液体中，37℃摇床过夜。（此步教师做,以下学生做,每人1管） 以下操作中，除离心步骤外，离心管均要放在冰上操作 2、将长好的菌液取 1.5ml倒入1.5ml的离心管，6000rpm离心2分钟。 3、尽量吸尽上清,留菌体。 4、加Solution I 100μl，用tip上下抽吸，打匀菌体沉淀，在冰上放5-6分钟。 5、加Solution II 200μl，tip上下抽吸，使浑浊菌体变清亮、粘稠。（此步处理时间小于5分钟） 6、加Solution III 150μl ， tip上下抽吸，在冰上放10分钟以上。 7、12000rpm离心10min，用tip吸出上清液转到新的离心管中（注意不要带沉淀）。 8、加相当于上清液2倍体积的预冷无水乙醇（ 840-860μl ），混匀后放入-20℃冰箱30分钟以上，以沉淀质粒。 9、12000rpm离心10min，倾去乙醇，用tip尽量吸去残余乙醇，再用电吹风吹干，干燥后加 30μl TE溶解质粒。标记姓名，放入冰箱-20℃保存。 电泳操作步骤 1、在1xTAE电泳缓冲液中加1- 1.2%的琼脂糖，加热使其融化。安置好制胶模板，待融化的琼脂糖胶温度降至50OC左右时，倒胶。凝固后，拔掉梳子，凝胶放入电泳槽。 （上步由教师做，以下由学生做） 2、点样：将已制备的质粒吸出10μl（剩余的仍放冰箱保存，以便下周使用），与2μl 蓝色点样缓冲液混匀，点入琼脂糖胶的电泳孔中，每个同学点1个孔。 3、电泳：用1-5V/cm 的电压,电泳到溴酚蓝和二甲苯青指示剂在凝胶的中段时停止电泳. 4、染色：胶置EB（溴化乙锭,有毒）中染色10分钟,自来水洗净。 5、看胶：用紫外凝胶成像仪和电脑成像系统观察结果，检测质粒的有无及浓度。 * * DNA带负电，在电场作用下向阳极移动。相对分子量越小，移动速度越快。对环状质粒来说，超螺旋构象快于线状，线状快于开环。由此原理，可用琼脂糖电泳将不同分子量的DNA片段或质粒分离。 琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理 菌株：含 质粒pUC19的 E.coli DH5α菌株 培养基：LB液体(+氨苄青霉素Ap 50μg/ml) 试剂：碱抽提质粒需用三种溶液，称为溶液I、Ⅱ、III 1、Sol I 50mM葡萄糖，10mM EDTA(乙二胺四乙酸二钠) 25mM Tris-HCl(pH8.0) 2、Sol II (临用时将NaOH 和SDS混合) 0.2M NaOH，1％SDS 3、Sol III 3M KAc-HAc缓冲液(pH4.8) 4、pH8的TE缓冲液 (溶解质粒用，含RNase) 5、琼脂糖 （制琼脂糖 凝胶） 6、pH8的TAE缓冲液(电泳检测用) 普通碱变性法抽提小分子量质粒电泳图